توصيل الخلايا الجذعية العصبية العلاجية (NSCs) داخل الأنف في نموذج الفئران: إجراء لتوصيل الخلايا الجذعية العصبية العلاجية المحملة بالورم في نموذج الفأر الحامل لورم الدماغ

الملخص

المصدر: Yu ، D. et al. توصيل الخلايا الجذعية العلاجية إلى الورم الأرومي الدبقي في نموذج الفأر. J. Vis. Exp.(2017)

يوضح هذا الفيديو التوصيل داخل الأنف للخلايا الجذعية العصبية العلاجية المحملة بفيروس الأورام في نموذج فأر يحمل ورم الدماغ. يتجاوز الإعطاء غير الجراحي للخلايا الجذعية الحاجز الدموي الدماغي ، مما يسهل توصيلها إلى موقع الورم في الدماغ للتطبيقات العلاجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التكييف المسبق لنقص التأكسج من NSCs البشرية (الشكل 1 أ)

1. يتم استزراع الصفائح في قوارير استزراع T75 حتى يتم الوصول إلى التقاء 90٪.
2. ضع قوارير زراعة الخلايا داخل حجرة/حاضنة_CO2 المرطبة مع الحفاظ على مستويات O₂ بنسبة 1٪ لمدة 24 ساعة، عبر إمداد غاز N₂ يتم التحكم فيه بواسطة مقياس تدفق آلي مدمج. يشار إلى هذه الخلايا باسم ^HNSCs. يتم إنشاء Control ^NNSCs على النحو التالي:
   1. الحفاظ على الخلايا العصبية العصبية البشرية (HB1.F3.CD الاستنساخ) في وسط DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية تحت 95٪ هواء الغرفة و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< p class = "jove_title" >2. تحميل الخلايا العصبية العصبية البشرية بفيروس حال للأورام (الشكل 1B-1H)

1. إصابة ^NNSCs و ^HNSCs ب 50 جزيئات / خلية فيروسية من الفيروسات الغدية التكاثرية المشروطة (CRAd) -S-pk7.
2. بعد ساعتين من الحضانة في درجة حرارة الغرفة مع النقر الدوري ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بالوسائط لإزالة الجزيئات الفيروسية غير المرتبطة وتعليق الخلايا في محلول ملحي معقم للحقن.
   أنذر: تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا في المختبر المتعلقة بالفيروس في المنشآت ذات التعيين المناسب لمستوى السلامة الحيوية ، مثل BSL2. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة من قبل الباحثين الذين يتعاملون مع فيروس حال للأورام وفقا لإرشادات المنشأة المؤسسية للحيوانات.

< p class = "jove_title" >3. التوصيل داخل الأنف لل NSCs العلاجية (الشكلان 1D و 2D)

1. استزراع وجمع NSCs (^NNSCs ، ^HNSCs).
2. تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين والزيلازين وفقا للإجراء:
   1. تخدير بناء على وزن الجسم باستخدام الكواشف المعتمدة ، أي إما عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) لخليط من الكيتامين (50-100 مجم / كجم ؛ استشر IACUC المؤسسي للحصول على نطاق الجرعة المعتمد) والزيلازين (5-10 مجم / كجم ؛ استشر IACUC المؤسسي للحصول على نطاق الجرعة المعتمد) في محلول ملحي معقم 200-250 ميكرولتر ، أو عن طريق تخدير الأيزوفلوران بنسبة 4-5٪ باستخدام جهاز استنشاقي.
3. ضع الفئران على ستارة نظيفة متجهة لأعلى مع وسادة تدفئة تحتها للحفاظ على درجة حرارة الجسم. اضبط وسادة مبطنة مصنوعة من مناشف ورقية ملفوفة بأشرطة لضمان الزاوية المستقيمة للأنف عند وضعها تحت رأس الماوس.
4. باستخدام ماصة دقيقة، قم بتوزيع 2 ميكرولتر من معلق NSC على كل فتحة أنف من الفأر. قم بتأكيد شفط القطرة بصريا قبل الانتقال إلى الماوس التالي. يمكن للمستخدم تحديد العدد الإجمالي للخلايا التي يتم تسليمها ؛ استخدم 62,500-125,000 خلية / ميكرولتر ، بحيث يمكن توصيل 0.5-1 مليون خلية بجرعات 4 × 2 ميكرولتر.
5. استخدم مؤقتا لضمان فواصل زمنية مدتها 5 دقائق بين كل إعطاء تعليق خلية، حتى 4 مرات.
6. اسمح للحيوانات باستعادة الحركة في غرفة الاسترداد ، مع الحفاظ على وضع ضعيف طوال الوقت.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مخطط انسيابي لإجراءات تحضير الخلايا الجذعية العامة المتضمنة قبل الولادة داخل الأنف. (أ - ج) المعالجة المسبقة لنقص التأكسج أو التعديلات الجينية للخلايا الجذعية للإفراط في التعبير عن CXCR4. (ب - د) يتم تنفيذ خطوات الغسيل والتفكك الأنزيمي وجمع الخلايا والعد للتحميل اللاحق للخلايا الجذعية بشحنات علاجية أو تشخيصية. (ه) يمكن تحميل الكوا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مستلزمات زراعة الخلايا (البلاستيك) ثيرموفيشر العلمي يتفاوت قابلة للاستبدال بأي مصدر Legend Micro 21R جهاز طرد مركزي دقيق مبرد ثيرموفيشر العلمي 75002490 قابلة للاستبدال بأي مصدر مقعد الطرد المركزي سورفال ST16R ثيرموفيشر العلمي 75004240 قابلة للاستبدال بأي مصدر