توليد الأورام الدقيقة: تقنية زراعة في المختبر لزراعة الأورام الدقيقة ثلاثية الأبعاد لتحليل الاستجابة للعلاج بالعقاقير

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: جيلبرت ، إيه إن وآخرون. جيل من الأورام الدقيقة باستخدام نظام ثقافة الجيل الحيوي البشري ثلاثي الأبعاد وخلايا الورم الأرومي الدبقي المشتق من المريض للتنميط الكينومي واختبار الاستجابة للأدوية. J. Vis. Exp. (2016)

< p class = "jove_content" >في هذا الفيديو ، نقوم بإنشاء أورام دقيقة من الخلايا السرطانية المشتقة من المريض باستخدام الهلام الحيوي البشري ثلاثي الأبعاد. تشبه هذه الأورام الدقيقة إلى حد كبير البيئة المكروية للورم في الجسم الحي وتعمل كمنصات محتملة لاختبار الأدوية.

البروتوكول

فئة

1. توليد الأورام الدقيقة

1. تحضير الكواشف
   1. قم بإعداد NBM كامل عن طريق إضافة ما يلي إلى زجاجة واحدة سعة 500 مل من الوسائط العصبية القاعدية (NBM) لتحضير NBM كامل: 10 مل من مكمل B-27 بدون فيتامين أ ، 5 مل N2 مكمل غذائي ، 100 ميكرولتر EGF ، 100 ميكرولتر عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) - أساسي ، 5 مل أمفوتريسين ب ، 0.5 مل جنتاميسين ، 5 مل L-glutamine وإعداد بيوجل حيوي بشري عالي الكثافة (HuBiogel) (HDHG عند 3 مجم / مل) لكل بروتوكول داخلي. يمكن أيضا استخدام مصفوفات بيوجيل مماثلة.
2. إنتاج الأورام الدقيقة وثقافتها
   1. احصل على خلايا PDX منفصلة حديثا كمعلق خلية واحدة في NBM كامل ، على الجليد.
   2. امزج معلق الخلية بحجم متساو من محلول التريبان الأزرق (0.4٪ في PBS) وقم بتحليله باستخدام مقياس كثافة الدم لتحديد عدد الخلية وقابليتها للبقاء عن طريق استبعاد الtrypan blue. قم بإزالة الحجم اللازم لتوليد 50,000 خلية / ورم دقيق حيث الحجم = (50,000 خلية / ورم * # أورام) / (عدد الخلايا القابلة للحياة / 1 مل) ووضعه في أنبوب مخروطي جديد.
   3. تركيز الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 150 × جم ، لمدة 8 دقائق ، في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية بمحلول HDHG المثلج في نسبة نهائية من 1 جزء من الخلايا في FBS و 4 أجزاء HDHG.
   4. استخدم ماصة إلكترونية متعددة القنوات لتوزيع 10 ميكرولتر لكل خليط HDHG لكل خلية دبوس على صفيحة فولاذية ذات 96 سنا (مع طلاء كاره للماء) لتوليد أورام دقيقة (حبات 2 مم تحتوي كل منها على 50,000 خلية).
   5. ضع حبات الورم ثلاثية الأبعاد داخل حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، رطب) لمدة 15 دقيقة لجلبة الخرز.
   6. بعد الهلام، انقل الأورام الدقيقة (10 ميكرولتر) إلى غرفة ثقافة معلق مخصصة (50 مل) أو طبق استزراع كبير الحجم (10 سم) يحتوي على NBM كامل باستخدام الماصة الإلكترونية متعددة القنوات وجهاز الدبوس المخصص.
   7. بعد 1-2 أيام في حاضنة زراعة الأنسجة ، انقل الأورام الدقيقة إلى ألواح مزرعة 96 بئرا تحتوي على 50 ميكرولتر NBM / بئر باستخدام ماصة توزيع واسعة الفم وإجراء بروتوكولات الفحص والتحليل المختلفة.
3. العلاج الدوائي والحفاظ على الأورام الدقيقة
   1. حدد التركيزات النهائية لاختبار المخدرات.
      ملاحظة: إذا كان الدواء معروفا بفعالية في ثقافة 2D ، فحدد 2x IC50 كتركيز الجرعة المتوسطة وحدد التخفيفات التسلسلية 3 أضعاف أعلى وأسفل ليصبح المجموع 5 مستويات جرعة. على سبيل المثال ، إذا كان IC50 يساوي 9 ميكرومولار للدواء في ثقافة ثنائية الأبعاد ، فحدد 2 ميكرومتر ، 6 ميكرومتر ، 18 ميكرومتر ، 54 ميكرومتر ، و 162 ميكرومتر كتركيز نهائي لاختبار الأدوية.
   2. قم بإعداد محلول جرعات الدواء 2x في NBM كامل من مخزون ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يخفف محلول الجرعات في وسط DMSO 1٪ لتحضير 5 جرعات ، تخفيف تسلسلي 3 أضعاف.
   3. أضف 50 ميكرولتر من محلول الجرعات إلى بئر الورم الدقيق الذي يحتوي على 50 ميكرولتر في ألواح الفحص لتحقيق تركيز DMSO نهائي بنسبة 0.5٪. كرر لكل تكرار (على سبيل المثال ، 4) في كل جرعة دواء محددة في الخطوة 1.3.1.
   4. الحفاظ على المزارع في 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة لمدة 1-14 يوما. قم بإطعام المزارع مرتين أسبوعيا عن طريق تحديث الوسائط ومحلول الأدوية على النحو الوارد أعلاه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كولاجيناز I سيجما ألدريتش ثاني أكسيد الكربون 130 عصبي - أ تقنيات الحياة 10888-022 ملحق N-2 تقنيات الحياة 17502-048 1x التركيز النهائي مكمل B-27 بدون فيتامين أ تقنيات الحياة هاتف: 12587-010 1x التركيز النهائي المؤتلف البشري FGF-basic تقنيات الحياة PHG0266 10 نانوغرام / مل التركيز النهائي ل-جلوتامين كورنينج سيلجرو ميدياتك 25-005-CI تركيز نهائي 2 ملي مولار الجنتاميسين تقنيات الحياة 15750-060 50 نانوغرام / مل التركيز النهائي تريبان بلو بيرس ثرموساينتيفيك 15250-061 هوبيوجيل عالي الكثافة فيفو بيوساينسز HDHG-5 DMSO صياد بي إب 231 لإذابة الكالسين AM والمركبات محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع Ca / Mg كورنينج سيلجرو ميدياتك 20-030-السيرة الذاتية مخفف إلى 1x بماء MiliQ فائق النقاء (للغسيل قبل التثبيت) 10٪ فورمالين محايد مخزن بروتوكول 032-060 أطباق بتري زجاجية 100 مم صياد 08-748 د