مقالة منهجية

تحريض الورم الأرومي الدبقي باستخدام التبديل بوساطة SB: تقنية لتوليد نموذج فأر جديد باستخدام التكامل بوساطة الينقولات لبلازميد SB في دماغ الفأر حديثي الولادة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Calinescu ، A. A. et al. التكامل بوساطة الينقولات للحمض النووي البلازميد في المنطقة تحت البطينية للفئران حديثي الولادة لتوليد نماذج جديدة من الورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2015)

يصف هذا الفيديو تقنية فعالة للحث على الأورام الأرومية الدبقية (GBM) باستخدام الحمض النووي المنقولات المحقون في بطينات الفئران حديثي الولادة. خلايا المنطقة تحت البطينية ، التي تمتص البلازميد ، تتحول وتتكاثر وتولد أورام ذات خصائص نسيجية مرضية ل GBM البشري.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. الحقن داخل البطين لحديثي

الولادة
  1. قبل ثلاثة إلى أربعة أسابيع من التجربة ، قم بإعداد قفص تربية فأر مع ذكر وأنثى فأر ، وكخي الإسكيمو البلاستيكي الملون. هذا يوفر بيئة غنية ويساعد في عملية التزاوج.
  2. عندما يتم تأكيد الحمل ، قم بإزالة الذكر إلى قفص جديد. بعد ثمانية عشر يوما من التزاوج ، راقب القفص يوميا للولادة. إجراء الحقن داخل البطينين في اليوم 1 بعد الولادة (P1).
  3. تحضير محلول الحقن.
    ملاحظة: يتم تصنيع محلول الحقن عن طريق خلط الحمض النووي البلازميد مع كاشف التعداء لإنشاء جزيئات التعدين. فيما يلي مثال على تحضير محلول الحقن باستخدام بلازميد يشفر ترانسبوزاز Sleeping Beauty و luciferase: pT2 / SB100x-Luc واثنين من البلازميدات الترانسبوسونية: pT / CAGGS-NRASV12 و pT / CMV-SV40-LgT ، بنسبة 1: 2: 2. يبلغ تركيز جميع البلازميدات 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
    1. تحضير محلول الحمض النووي عن طريق إضافة: 4 ميكروغرام (2 ميكرولتر) من pT2 / SB100x-Luc ، و 8 ميكروغرام (4 ميكرولتر) من pT / CAGGS-NRASV12 و 8 ميكروغرام (4 ميكرولتر) من pT / CMV-SV40-LgT و 10 ميكرولتر من الجلوكوز 10٪ إلى حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر بتركيز 1 ميكروغرام / مل من الحمض النووي و 5٪ جلوكوز.
    2. قم بإعداد محلول PEI عن طريق إضافة 2.8 ميكرولتر من PEI في الجسم الحي ، و 7.2 ميكرولتر من الماء المعقم ، و 10 ميكرولتر من الجلوكوز بنسبة 10٪ إلى التركيز النهائي بنسبة 5٪ من الجلوكوز.
    3. أضف محلول PEI إلى محلول الحمض النووي ، واخلطه واتركه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. المحلول جاهز الآن للحقن. بعد ساعة واحدة في RT ، احتفظ بالمحلول على الجليد.
    4. ضع حقنة نظيفة سعة 10 ميكرولتر مزودة بإبرة تحت الجلد 30G مع شطبة 12.5 درجة في المضخة الدقيقة (الشكل 1 # 1).
  4. للتحقق من الأداء السليم لنظام الحقن ، استخدم الحاقن الأوتوماتيكي (الشكل 1 # 1) لسحب 10 ميكرولتر من الماء إلى المحقنة ثم إفراغ المحقنة تماما.
  5. قم بتبريد المرحلة التجسيمية لحديثي الولادة (الشكل 1 # 3) بملاط من الثلج الجاف والكحول إلى درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
  6. تحفيز التخدير عن طريق وضع الجراء على الجليد الرطب لمدة دقيقتين ، وسيستمر التخدير على الإطار التجسيمي المبرد لبقية الإجراء. الحفاظ على درجة حرارة الإطار فوق درجة التجمد ، بين 2-8 درجة مئوية سيمنع إصابات الحروق الحرارية. كاحترازات خاصة ، يمكن لف الجراء بشاش قبل وضعها على الجليد الرطب.
  7. املأ المحقنة بمحلول الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد.
  8. شل حركة الجرو في الإطار التجسيمي عن طريق وضع رأسه بين قضبان الأذن المغطاة بالشاش (الشكل 1 ب). تأكد من أن الجانب الظهري من الجمجمة أفقي ، مواز لسطح الإطار وأن خيوط الجمجمة مرئية بوضوح. امسح الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  9. اخفض إبرة المحقنة واضبط الإحداثيات التجسيمية باستخدام أقراص الإطار التجسيمي حتى تلمس الإبرة لامدا (تقاطع خط الوسط للعظام الجدارية والقذالية) (الشكل 1 ب).
  10. ارفع الإبرة واضبط الإحداثيات التجسيمية على 0.8 مم جانبي و 1.5 مم منقاري إلى لامدا (الشكل 1 ب).
  11. اخفض الإبرة حتى تلامس الجلد وتغمله قليلا. قم بقياس الإحداثيات. اخفض الإبرة 1.5 مم أخرى. سوف تخترق الإبرة الجلد والجمجمة ، وتمر عبر القشرة لتدخل البطين الجانبي (الشكل 1 ج).
  12. باستخدام الحاقن الأوتوماتيكي ، قم بحقن 0.75 ميكرولتر من محلول DNA / PEI بمعدل 0.5 ميكرولتر / دقيقة.
  13. احتفظ بالجرو على الإطار لمدة دقيقة أخرى للسماح للمحلول بالتشتت في البطينين. في غضون ذلك ، قم بتخدير جرو آخر ، على الجليد لمدة دقيقتين استعدادا للحقن التالي.
  14. ارفع الإبرة برفق وببطء ، وضع الجرو تحت مصباح تدفئة. مراقبة التنفس والنشاط. إذا لزم الأمر ، قم بتوفير تحفيز لطيف للأطراف حتى يبدأ التنفس الأول.
  15. أعد الجرو إلى والدته بعد أن يسخن ، ويصل إلى اللون الوردي ، ويتنفس بانتظام ويكون نشطا ، عادة 5-7 دقائق. إذا تم حقن أكثر من جرو واحد في وقت واحد ، احتفظ بجميع الجراء معا حتى يتم الانتهاء من جميع الحقن. إذا استغرقت الحقن أكثر من 30 دقيقة ، فأعد نصف الجراء بعد أول 30 دقيقة والباقي في نهاية الإجراء.
  16. راقب أن السد يستجيب ويرعى صغارها. إذا لزم الأمر ، أضف أم بديلة إلى القفص.
  17. تأكد من أن الفاصل الزمني بين وضع الجرو على الجليد ووضعه تحت مصباح التدفئة أقل من 10 دقائق. كلما كان الإجراء أسرع كلما كان البقاء على قيد الحياة أفضل. عادة ما يكون الوقت المستغرق لتخدير الجرو وحقنه هو 4 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: الإعداد التجريبي والأدلة للحقن داخل البطين في الفئران حديثي الولادة. (أ)ويأتي إطار تجسيمي (2) مزود بأقراص ميكرومتر حاقن أوتوماتيكي يحمل حقنة سعة 10 ميكرولتر (4). داخل إطار U ، يتم تثبيت إطار محول حديثي الولادة بإحكام (3). تسمح لوحة التحكم الخاصة بالحاقن الآلي (1) بالاختيار الدقيق للحقنة والحجم ومعدل التدفق. (ب) صورة فوتوغرافية لفأر حديثي الولادة (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات معيار مختبر Stoelting مع محولات الفئران والفئران ستويلتينج 51670 تنتج شركات أخرى إطارات مماثلة ، أي منها مع محولات الماوس الصغيرة مناسبة حاقن التجسيمي الجوهري (QSI) ستويلتينج 53311 يمكن إجراء الحقن بدونها ، لكن الحاقن التلقائي يسمح بزيادة قابلية التكاثر والراحة حقنة MICROLITER من سلسلة 10 ميكرولتر مجهزة يدويا هاملتون نموذج 701 سيوفر نموذج الحقنة هذا من 0.5 إلى 500 ميكرولتر من المحلول بشكل موثوق. يمكن أيضا استخدام محاقن أخرى (على سبيل المثال 5 ميكرولتر ، موديل 75) 30 إبرة تحت الجلد قياس (1.25 "، 15 ^ {o} شطبة) هاملتون S / O # 197462 هذه الإبرة مثالية لثقب جلد وجمجمة الفأر حديثي الولادة دون الحاجة إلى إجراءات جراحية أخرى. إذا أصبح باهتا (لا يدخل الجلد بسهولة) ، فيجب استبداله. في الجسم الحي نفاثة PEI تعداء بول بلس 201-10 جرام Aliquot بكميات صغيرة واحتفظ بها عند -20 درجة مئوية د-لوسيفيرين ، ملح البوتاسيوم Goldbio.com لوك كي-1 جرام المصادر الأخرى لليراع lucifierase كافية محلول الهيماتوكسيلين ، تعديل هاريس سيجما ألدريتش HHS128-4L

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SB

مقالات ذات صلة