$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تشريح
ملاحظة: الظروف المعقمة غير مطلوبة ما لم يتم استخدام الأوعية لأغراض زراعة الخلايا. تحضير محاليل الأوعية العازلة: B1 ، أضف 1.5 مل من HEPES 1M إلى 150 مل من HBSS ؛ B2 ، أضف 3.6 جم من Dextran إلى 20 مل من B1 ؛ B3 ، أضف 1 جم من BSA إلى 100 مل من B1.
- تحضير دورق سعة 150 مل مع 20 مل من B1. يحفظ على الثلج ويغطى بالبارافيلم لتجنب تلوث الهواء.
قم - بتخدير الماوس بعمق تحت غطاء المحرك بمنشفة ورقية صغيرة مبللة ب 1 مل من الأيزوفلوران النقي الذي يضاف إلى القفص. يتم التحقق من التخدير من خلال عدم وجود رد فعل على قرصة إصبع القدم. اقتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم.
ملاحظه: يتم إنجاز هذه الخطوات وفقا للوائح الوطنية والمؤسسية.
- اختياري: قم بإجراء التروية داخل القلب مع 20 مل من PBS 1x للتخلص من محتوى الدم.
- قسم الجلد بمشرط من الرقبة إلى الأنف واسحبه بعيدا. قم بإزالة جميع الشعيرات الملوثة باستخدام PBS 1x.
- لفتح الجمجمة ، أولا ، أدخل المقص الأمامي إلى البصلة الشمية ، وافتح المقص لتمزيق الجمجمة إلى جزأين.
- قم بإزالة الدماغ بعناية باستخدام ملعقة دماغية. قم بتشريح الضفيرة المشيمية من البطينين الجانبيين لأنها قد تلوث تحضير الأوعية الدموية.
ملاحظه: اختياري: سيحتوي المستحضر النهائي على أوعية متني وسحايا. إذا لم تكن ترغب في ذلك ، يمكن تقشير السحايا.
- انقل الدماغ إلى الدورق الذي يحتوي على محلول B1 على الجليد. يمكن علاج ما يصل إلى 8 أدمغة معا.
< p class = "jove_title" >
2. تجانس أنسجة المخ
- باستخدام مشارطين ، تغلب يدويا وبقوة على الدماغ في محلول B1 ، ثم احصل على قطع صغيرة يبلغ طولها حوالي 2 مم.
- قم بتجانس المستحضر باستخدام الخالط Dounce الآلي ، مع أداء 20 ضربة عند 400 دورة في الدقيقة. تأكد من الحفاظ على الأنبوب الزجاجي في الجليد وأن الجزء العلوي من المثول في المحلول عند التحرك لأعلى ولأسفل ، وذلك لمنع تكوين الجيوب الهوائية. إذا تم تحضير عدة عينات ، اغسل الكرسي بالماء المتأين بين كل تجانس.
فئة
3. تنقية الأوعية
- انقل الجانس إلى أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل وانتقل إلى الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. ستتشكل واجهة بيضاء كبيرة (معظمها من المايلين) في الجزء العلوي من حبيبات الوعاء (أحمر إذا لم يتم إجراء التروية).
- تخلص من المادة الطافية. ستظل حبيبات الوعاء والواجهة البيضاء متصلتين ببعضهما البعض. أضف 20 مل من محلول B2 المثلج ورج الأنبوب يدويا وبقوة لمدة 1 دقيقة.
- انتقل إلى الطرد المركزي الثاني عند 4,400 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سيشكل المايلين الآن طبقة بيضاء كثيفة على سطح المادة الطافية.
- افصل طبقة المايلين بعناية عن جدران الأنبوب عن طريق إمساك الأنبوب وتدويره ببطء للسماح للمادة الطافية بالمرور على طول الجدران. تخلص من المايلين مع المادة الطافية. تظل الحبيبات التي تحتوي على الأوعية متصلة في قاع الأنبوب.
- امسح الجدار الداخلي للأنبوب بورق ماص ملفوف حول ماصة بلاستيكية سعة 5 مل وقم بإزالة جميع السوائل المتبقية ، وتجنب لمس حبيبات الوعاء. احتفظ بالأنبوب مقلوبا على ورق ماص لتصريف أي سائل متبقي.
- قم بتعليق الحبيبات في 1 مل من محلول B3 المثلج عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل بأطراف منخفضة الارتباط ، مع إبقاء الأنبوب على الجليد ، ثم أضف 5 مل أخرى من محلول B3. تأكد من أن السفن مشتتة قدر الإمكان ولا تشكل مجاميع.
فئة < ص = "jove_title" >
4. الترشيح
- قم بإعداد دورق على الثلج مع 30 مل من محلول B3 المثلج. قم بتغطيتها بالبارافيلم لتجنب تلوث الهواء.
- ضع مرشحا شبكيا 20 ميكرومتر على حامل مرشح معدل أعلى قارورة بيكر وقم بالتوازن عن طريق تطبيق 10 مل من محلول B3 المثلج.
- صب مستحضر الوعاء على الفلتر واشطف الأوعية ب 40 مل من محلول B3 المثلج.
- استرجع الفلتر باستخدام ملقط نظيف واغمره على الفور في الدورق الذي يحتوي على محلول B3. افصل الأوعية عن الفلتر عن طريق رجها برفق.
- صب محتوى الدورق في أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية < br / >
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن ترشيح تعليق الأوعية الدماغية من الخطوة 3.6 على مرشح شبكي 100 ميكرومتر. في هذه الحالة ، يتم الاحتفاظ بالأوعية الأكبر حجما بشكل تفضيلي على المرشح بينما يحتوي التدفق على أوعية دقيقة (شعيرات دموية بشكل أساسي) ، والتي يتم ترشيحها بعد ذلك على مرشح شبكي 20 ميكرومتر على النحو الوارد أعلاه.
- قم بتعليق حبيبات الأوعية الدقيقة في 1 مل من محلول B3 المثلج ونقلها عن طريق ماصتها إلى أنبوب Eppendorf سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.