فحص البلعمة في المختبر: طريقة قائمة على التصوير الحي لدراسة البلعمة المشبكية بوساطة الخلايا النجمية في الوقت الفعلي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Byun ، Y. G. ، Chung ، W. S. فحص التصوير المباشر في المختبر لبلعمة الخلايا النجمية بوساطة الخلايا النجمية باستخدام المشابك المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نقوم بتقييم القدرة البلعمية للخلايا النجمية المنقاة في المختبر عن طريق فحص التصوير المباشر. يعمل الاختبار كمنصة فحص فعالة لتحديد المركبات الكيميائية التي يمكن أن تعزز أو تثبط قدرة الخلايا النجمية على البلعمة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص التصوير الحي للبلعمة (الشكل 1)

1. قم بإعداد طبق مكون من 24 بئرا (أو أي طبق / طبق يتم إعداده للتصوير الحي) حيث تتلاقى الخلايا النجمية (بشكل عام ، من 7 إلى 10 أيام من الحضانة بعد التنقية مثالية لتثبيت الخلايا).
2. قم بإزالة الوسائط الموجودة في كل بئر واغسل الآبار ب 1 مل من محلول ملحي الفوسفات العازل (DPBS) من Dulbecco ، ثلاث مرات. لتقليل التعرض للهواء ، اغسل الآبار بسرعة.
3. أضف 300 ميكرولتر من الوسائط الأساسية للخلايا النجمية المناعية (IP-ABM) مع 5 ميكرولتر من الجسيمات العصبية المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني وعوامل إضافية مثل الوسائط المكيفة بالخلايا النجمية المناعية (IP-ACM) التي يمكنها تعديل بلعمة الخلايا الدبقية.
4. احتضن اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 40 دقيقة. تسمح هذه الخطوة للجسيمات العصبية المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني بالاستقرار في قاع الصفائح.
5. قم بإزالة الوسائط ذات المشابك العصبية غير المرتبطة بمؤشر الأس الهيدروجيني وغسل كل بئر ب 1 مل من DPBS ، ثلاث مرات.
   أنذر: لا تغسل بقسوة. لتقليل التعرض للهواء ، اغسل الآبار بسرعة.
6. أضف 500 ميكرولتر من IP-ABM مع عوامل إضافية لاختبارها في الآبار.
7. اصطحب اللوحة إلى أداة التصوير المباشر وحدد المواضع. اضبط التركيز ووقت التعرض والسطوع وطاقة LED.
   ملاحظه: تتغير إعدادات وقت التعرض والسطوع وطاقة LED اعتمادا على شدة التألق والغرض من التجربة. في مقايسة التصوير المباشر مع المشابك العصبية المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني ، عادة ما نحدد هذه القيم على النحو التالي: التعرض: ~ 150-200 مللي ثانية ، السطوع: 15 ، وطاقة LED: 4-6.
8. قم بتعيين تنسيق الصورة والفاصل الزمني والعدد الإجمالي للدورات للتصوير المباشر. اضبط الفاصل الزمني على 1 أو 2 ساعة بناء على عدد المواضع المحددة. يوصى بفواصل زمنية مدتها ساعتان عند تحديد أكثر من 150 موضعا للتصوير المباشر.
9. ابدأ تجارب التصوير المباشر.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تخطيطي لمقايسة التصوير الحي للبلعمة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات phrodo أحمر ، إستر السكسينيميديل مجسات الجليزيئات P36600 لاقتران مؤشر الأس الهيدروجيني مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو 16000-044 DMEM جيبكو 11960-044 موصل البيانات التفاعلية [ولجن] رطل 001-02 فحص التصوير الحي للبلعمة مرحلة جولي نانو إنتيك الإضافات لمحلل السلسلة الزمنية V3 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html