التثقيب الكهربائي خارج الجسم الحي لشرائح مخيخ جنين الكتكوت: طريقة لإدخال الحمض النووي البلازميد الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر لتصور تطور الخلايا الحبيبية

الملخص

المصدر: Hanzel ، M. et al. ثقافة Ex vivo لشرائح المخيخ والتعقيم الكهربائي المستهدف مكانيا لسلائف الخلايا الحبيبية.J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء التثقيب الكهربائي لشرائح مخيخ جنين الكتاكيت باستخدام بلازميدات الجينات المراسلة. تسهل هذه التقنية تصور تطور وهجرة سلائف الخلايا الحبيبية لتشكيل طبقة حبيبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التثقيب الكهربائي للشرائح

1. قم ببناء غرفة التثقيب الكهربائي عن طريق تثبيت أنود المثقب الكهربائي على قاعدة طبق بتري 60 مم بشريط عازل. أضف ما يقرب من 1 مل من HBSS لتغطية القطب.
2. ضع حشوة ثقافة 0.4 ميكرومتر أعلى القطب المغطى ب HBSS. اسمح لملحق المزرعة بالاستقرار على القطب الكهربائي مع التأكد من وجود اتصال دائما بين الملحق والقطب.
   ملاحظه: في هذا الإعداد ، سيستقر إدراج الثقافة مع الشرائح على سطح المحلول ، مما يحافظ على الدائرة مع السماح بالاستهداف المكاني للكاثود.
3. انقل الشرائح المحددة (حتى خمس شرائح لكل إدراج مزرعة) إلى حشوة المزرعة باستخدام ماصة باستور سعة 3 مل مع الطرف المقطوع. افصل واتركه يستقر على إدراج الثقافة في اتجاه سهمي.
4. باستخدام ماصة ، قم بإزالة HBSS الزائدة بحيث لا يتم غمرها الشرائح في المحلول.
5. باستخدام طرف ماصة P10، يتم تخفيف الحمض النووي للماصة (بتركيز 1 ميكروغرام/ميكرولتر) باللون الأخضر السريع بنسبة 20٪ على سطح المنطقة المستهدفة من الشريحة. يضمن اللون الأخضر السريع بنسبة 20٪ محلول الحمض النووي اللزج ويمنع تشتت الحمض النووي على نطاق واسع. أضف ما يقرب من 5 ميكرولتر من الحمض النووي / محلول أخضر سريع لكل شريحة (الشكل 1 ب).
6. ضع الكاثود فوق الأنسجة المستهدفة المرغوبة والتثقية الكهربائية بنبضات 3 × 10 فولت ، 10 مللي ثانية. تجنب الاتصال المباشر للكاثود بالأنسجة. بدلا من ذلك ، استفد من التوتر السطحي للسائل للحفاظ على التوصيل (ضع الكاثود بالقرب من الأنسجة قدر الإمكان دون لمس الأنسجة فعليا).
7. كرر توصيل الحمض النووي والتثقيب الكهربائي إلى مناطق متعددة من EGL على كل شريحة مخيخية على حدة حسب الرغبة.
8. عند الانتهاء من التثقيب الكهربائي ، انقل إدراج الثقافة إلى طبق بتري 30 مم.
9. إلى كل مزرعة ، أضف 1 مل من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا (النسر القاعدي المتوسط ، 0.5٪ (وزن / حجم) D- (+) - جلوكوز ، 1٪ مكمل B27 ، 2 ملي لتر جلوتامين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) أسفل إدراج المزرعة بحيث يكون ملحق المزرعة ملامسا للوسط ، ولكن لا يتم غسل الشرائح فيه.
10. احتضان المزارع عند 37 درجة مئوية / 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة تصل إلى 3 أيام. استبدل كل وسط الاستزراع كل 24 ساعة بوسط طازج مسخن مسبقا.
11. بعد الاستزراع ، قم بتثبيت الشرائح على إدخالات المزرعة لمدة 1 ساعة في 4٪ بارافورمالدهيد (أو O / N عند 4 درجات مئوية) في طبق طازج مقاس 30 مم بدون وسائط استزراع.

النتائج

الشكل 1. غرفة التثقيب الكهربائي التي تم إعدادها. (أ) صورة لغرفة التثقيب الكهربائي المصنوعة خصيصا. تتكون الغرفة من أنود من المثقب الكهربائي الموضوع بإحكام على قاعدة طبق بتري 60 مم. يحتوي الطبق على ما يقرب من 1 مل من HBSS لتغطية القطب. يجب أن يستقر ملحق الثقافة على القطب الكهربائي مع اتصال مستمر بين الملحق والقطب الكهربائي ، مما يحافظ على الدائرة مع السماح بالاستهداف ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات النسر القاعدي المتوسط (جيبكو) تقنيات الحياة 41010-026 ل-جلوتامين سيغما جي 7513 البنسلين / الستربتومايسين سيغما ص 4333 0.4 ميكرومتر إدراج الثقافة ميليبور PICM0RG50 TSS20 Ovodyne الكهربائي إنتراسل 01-916-02 استخدم نبضات 3 × 10 فولت 10 مللي ثانية للتثقيب الكهربائي.