مقالة منهجية

تشريح المخيخ وتحضير الشرائح: طريقة لتوليد شرائح الأنسجة من مخيخ الفأر

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Thetiot ، M. et al. التحضير والتلوين المناعي لثقافات شرائح المخيخ العضوية النخاعي. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو طريقة لتوليد شرائح الأنسجة من مخيخ الفأر. يمكن استخدام شرائح المخيخ في زراعة النمط العضوي الذي يوفر نظرة ثاقبة لآليات النمو العصبي ، بما في ذلك ديناميكيات تكوين النخاع.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تشريح المخيخ وإعداد الأقسام (وقت التدريب العملي ≈ 15-20 دقيقة لكل)

  1. ضع أحد أطباق زراعة الخلايا مقاس 60 مم التي تحتوي على وسط تشريح الثلج البارد تحت المجهر المجهري وقم بإزالة اللوحة العلوية.
  2. امسح فرو الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول (تجنب لمس عيون بعناية) واقطع رأس باستخدام مقص حاد كبير ، وفقا للإجراء المعتمد.
    ملاحظة: يتم إنشاء شرائح المخيخ من الفئران P9-P10 دون أي جنس محدد أو تحيز سلالة.
  3. استخدم مقصا صغيرا لقص الجلد على طول خط الوسط للرأس بدءا من الرقبة وحتى كمامة الفأر.
  4. لإمساك الرأس وفضح الجمجمة ، قم بطي الجلد بطنيا تحت الرأس ، واضغط على ثنية الجلد بين أصابع المرء.
  5. أدخل المقص الصغير برفق في الثقبة ماغنوم وقم بقص الجمجمة عن طريق عمل شق جانبي واحد باتجاه الجانب ثم قم بقص جمجمة الرأس بالكامل. احتفظ بطرف المقص متوازيا وقريبا من الجمجمة قدر الإمكان أثناء القص لتجنب إتلاف أنسجة المخ.
  6. استرجع الجزء الظهري من الجمجمة باستخدام ملقط مستقيم دقيق. أثناء رفع الجزء الظهري من الجمجمة بعناية ، قم بقطع السحايا الملتصقة (غشاء مروي شفاف يحيط بأنسجة المخ) إذا لزم الأمر بمقص صغير لتجنب إتلاف أنسجة المخ.
  7. أدخل ملقطا مستقيما دقيقا بعناية (أو استخدم ملعقة) بين الجمجمة البطنية والدماغ ، واقلب الدماغ برفق واقطع الأعصاب البصرية وثلاثية التوائم بمقص صغير.
  8. ساعد الدماغ على السقوط بالجاذبية في طبق زراعة الخلايا مقاس 60 مم الذي يحتوي على وسط تشريح مثلج عن طريق قلب الرأس رأسا على عقب فوق الطبق مباشرة وتحرير الالتصاقات الأخيرة بمقص صغير إذا لزم الأمر.
  9. باستخدام ملقط دقيق ، قم بتوجيه الدماغ بحيث يكون الجانب الظهري مواجها للباحث ، والجانب البطني ملقى في قاع الطبق.
  10. تحت المجهر المجهري ، استخدم الملقط الدقيق المستقيم لشل حركة الدماغ على جانب الدماغ الأمامي وتجنب لمس الدماغ الخلفي ، حيث يمكن أن يتضرر. افصل الدماغ الخلفي عن بقية الدماغ (الدماغ الأمامي والمتوسط ، انظر التخطيطي في الشكل 1Aa) ، باستخدام ملقط مستقيم دقيق. لفصل المخيخ عن بقية الدماغ الخلفي ، استخدم الملقط الدقيق لقطع سيقان المخيخ أسفل المخيخ (انظر التخطيطي في الشكل 1Aa').
  11. بمجرد عزل المخيخ ، قم بتمزيق السحايا بعناية باستخدام ملقط مستقيم ناعم (انظر التخطيطي في الشكل 1Aa').
  12. أمسك المخيخ برفق باستخدام الملقط المنحني الدقيق وضعه مع الجانب الظهري لأعلى على المنصة البلاستيكية بشكل عمودي على شفرة الحلاقة المروحية (انظر التخطيطي في الشكل 1 ب ب).
  13. استنشق أي فائض من وسط التشريح حول المخيخ باستخدام طرف ماصة معقم رفيع الطرف تم تكييفه على ماصة سعة 1 مل (انظر التخطيطي في الشكل 1 ب ب).
  14. تأكد من أن المخيخ مسطح ، ولكن ليس ممتدا ، بمجرد وضعه على المنصة للحصول على شرائح سهمية مثالية أثناء التقسيم (انظر التخطيطي في الشكل 1 ب ب).
  15. قم بتقطيع أقسام سهمية بسمك 300 ميكرومتر من المخيخ باستخدام مفرمة المناديل (انظر التخطيطي في الشكل 1 ب ب). يجب تحسين قوة وسرعة الشفرة في الموقع.
  16. أضف برفق قطرة من وسط التشريح على شرائح المخيخ. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف يوضع على ماصة سعة 1 مل ، قم بشفط المخيخ المقطع ببطء ونقله مرة أخرى إلى طبق زراعة الخلايا مقاس 60 مم الذي يحتوي على وسط تشريح مثلج بارد (انظر التخطيطي في الشكل 1 ب ب »).
  17. قم بتنظيف المنصة البلاستيكية لمفرمة المناديل باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪ بين كل تقطيع للمخيخ. دع الإيثانول يتبخر قبل وضع المخيخ التالي على المنصة.
  18. استخدم ملقطين مستقيمين دقيقين (أو بدلا من ذلك إبر التيتانيوم) لفصل الشرائح الفردية واختيار 6-8 شرائح من الدودة (انظر التخطيطي في الشكل 1 سم مكعب و 1 سم مكعب).
  19. خذ صفيحة من 6 آبار مع إدخالات مزرعة وانقل ما يصل إلى 4 شرائح مختارة إلى ملحق مزرعة واحد جنبا إلى جنب مع بعض وسط التشريح ، باستخدام طرف ماصة عريض التجويف تم تكييفه على ماصة سعة 1 مل (انظر التخطيطي في الشكل 1 سم مكعب).
  20. ضع الشرائح في منتصف ملحق المزرعة باستخدام وسيط التشريح أو الملقط لدفعها وسحبها برفق إلى المكان الصحيح ، مع تجنب ملامستها لبعضها البعض (انظر التخطيطي في الشكل 1 سم مكعب).
  21. قم بإزالة أي فائض من وسط التشريح حول الشرائح باستخدام طرف ماصة رفيع الطرف. تأكد من أن الشرائح مسطحة على الغشاء (انظر التخطيطي في الشكل 1 سم مكعب).
  22. ضع اللوحة المكونة من 6 آبار في الحاضنة فور إضافة الشرائح على الغشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: رسم توضيحي لتوليد شرائح المخيخ. ينقسم التشريح إلى ثلاث خطوات رئيسية. (أ) يتم عزل المخيخ وإزالة السحايا (الخطوتان 1.10 و 1.11). (ب) ثم يتم نقل المخيخ إلى منصة المروحية وتقطيعه إلى شرائح (الخطوات من 1.12 إلى 1.16). (ج) أخيرا ، يتم عزل الشرائح عن الدودة ووضعها على حشوة غشائية. تتم إزالة وسط التشريح المنقول مع الشرائح ويتم وضع ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات BME متوسط ثيرموفيشر العلمي 41010026 محلول الملح المتوازن من هانك (10x HBSS) ثيرموفيشر العلمي 14180046 جلوتا ماكس (100x) ثيرموفيشر العلمي 35050038 مصل الحصان المعطل بالحرارة ثيرموفيشر العلمي 26050088 البنسلين - الستربتومايسين (10.000 وحدة دولية / مل) ثيرموفيشر العلمي 15140122 محلول الملح المتوازن من Gey's سيجما ألدريتش G9779-500 مل محلول د-جلوكوز (45٪) سيجما ألدريتش G8769-100ML بارافورمالدهايد (PFA) علوم المجهر الإلكتروني 15714 [م] الإيثانول المطلق (100٪ إيثانول) كيماويات VWR 20821.33 تريتون® X-100 سيجما ألدريتش X100-500 مل تبرد عند -20 درجة مئوية 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) ثيرموفيشر العلمي 500622 محلول عازلة الفوسفات يوروميدكس ET330-أ مفرمة المناديل ماكلوين الرقم الهيدروجيني 7.4 شفرات الحلاقه مقص كبير ف.س.ت 14101-14 مقص صغير ف.س.ت 91500-09 ملقط مستقيم دقيق ف.س.ت 91150-20 ملقط منحني ودقيق ف.س.ت 11297-00 أطباق زراعة الخلايا (60 مم و 100 مم) برنامج النقاط التجارية لوحات ثقافة 4 ، 6 آبار برنامج النقاط التجارية إدخالات ثقافة Millicell (0,4 ميكرومتر ، قطر 30 مم) ميرك ميليبور PICM0RG50 حاضنة زراعة الخلايا أطراف ماصة دقيقة دوتشر 134000 سي ال 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 أطراف ماصة واسعة التجويف ثيرموفيشر العلمي 2079 جرام حقنة معقمة تيرومو أوروبا مرشحات حقنة معقمة تيرومو أوروبا 20 أو 50 مل مشرط سوان مورتون 510 ريال 0.22 ميكرومتر فرش شرائح المجهر RS فرنسا أغطية زجاجية RS فرنسا 76 مم × 26 مم × 1.1 مم مساحات الأنسجة Kimtech Sciences كيمبرلي كلارك بروفيشنال 5511 م 22 مم × 22 مم مجهر مجهر

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة