التثقيب الكهربائي لخلية واحدة في مزارع شرائح الدماغ العضوية: تقنية في المختبر لتوصيل البلازميدات داخل الخلايا العصبية المستهدفة في شرائح الحصين في الدماغ

الملخص

المصدر: Keener ، D. G. et al. التثقيب الكهربائي أحادي الخلية عبر ثقافة شرائح النمط العضوي المختلفة للخلايا العصبية المثبطة للحصين والحصين الخاصة بالفئة. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو بروتوكول التثقيب الكهربائي أحادي الخلية للجينات في كل من الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة عبر مجموعة من مزارع شرائح الحصين في المختبر. هذه التقنية مفيدة لفحص الوظائف الجزيئية والفسيولوجية المحددة للخلايا العصبية ، بما في ذلك آليات استقلالية الخلية وتفاعلات البروتين عبر المشبكي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إعداد ثقافة الشريحة

1. قم بإعداد مزارع شرائح الحصين العضوية للفأر باستخدام الفئران بعد الولادة التي تتراوح أعمارها بين 6 و 7 أيام من كلا الجنسين.
   1. تحضير وسائط التشريح لزراعة الشرائح العضوية المكونة من (بالمللي مولار): 238 سكروز ، 2.5 كيلوكلوريد ، 1 كلوريد_{كنسيوم 2} ، 4 ملجمكلوريد₂ ، 26 هيدروكسيد الصوديوم₃ ، 1 هيدروهيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ ، و 11 جلوكوز في الماء منزوع الأيونات ، ثم الغاز بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂/95٪ O₂ إلى درجة حموضة 7.4.
   2. تحضير وسائط زراعة شرائح عضوية تتكون من: 78.8٪ (حجم / حجم) الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي ، 20٪ (حجم / حجم) مصل الحصان ، 17.9 ملي NaHCO₃ ، 26.6 ملي جلوكوز ، 2 م كلوريد الكالسيوم₂ ، 2 م مجم₄ ، 30 ملي هيبس ، الأنسولين (1 ميكروغرام / مل) ، و 0.06 ملي مولار حمض الأسكوربيك ، الرقم الهيدروجيني المعدل إلى 7.3. اضبط الأسمولية على 310-330 أوسمول باستخدام مقياس التناضح.
   3. قم بتشريح الحصين من الدماغ كله باستخدام ملعقتين ، وقم بتقطيعه (400 ميكرومتر) باستخدام مفرمة الأنسجة. افصل الشرائح باستخدام ملقطين وانقلها إلى إدخالات مزرعة خلية مقاس 30 مم في صفيحة 6 آبار مملوءة بوسائط الاستزراع (950 ميكرولتر) أسفل الحشوات.
2. قم بتخزين مزارع الشرائح العضوية في حاضنة زراعة الأنسجة (35 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) وقم بتغيير وسائط زراعة الشرائح كل يومين.

< p class = "jove_title" >2. تحضير البلازميد

1. تحضير البلازميد للجين محل الاهتمام.
   1. الاستنساخ الفرعي يعزز جين البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في ناقل pCAG.
   2. قم بتنقية بلازميد pCAG-EGFP باستخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية وقم بإذابتها في محلول داخلي يتكون من مياه معالجة بثنائي إيثيل بيروكربونات تحتوي على 140 ملي مولار K-methanesulfonate و 0.2 mM EGTA و 2 mM MgCl₂ و 10 mM HEPES ، معدلة إلى درجة الحموضة 7.3 مع KOH (تركيز البلازميد: 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر).

< p style="الهامش الأيسر:1in;">

فئة

3. تحضير الماصة الزجاجية

1. اسحب الماصات الزجاجية البورسليكات (4.5-8 MΩ) على مجتذب ماصة دقيقة (الشكل 1A).
   ملاحظه: تعتبر الماصات الزجاجية المستخدمة في تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة مثالية للتثقيب الكهربائي.
2. اخبزي الماصات الزجاجية طوال الليل على حرارة 200 درجة مئوية لتعقيمها.
3. تحقق من حجم طرف الماصة تحت مجهر التشريح لتقريب المقاومة الكهربائية.
   1. اختياري: تحقق من مقاومة الماصة عن طريق توصيل الماصة بقطب التثقيب الكهربائي واستخدم الملاعب الدقيقة لمناورة طرف الماصة في السائل النخاعي النخاعي الاصطناعي المعقم بالترشيح (aCSF) الذي يحتوي على (بالمللي مولار): 119 كلوريد الصوديوم ، 2.5 كلوريد الوسيوم ، 0.5 كلوريد_{المكليوم 2} ، 5 ملجمكلوريد₂ ، 26 هيدروكسيد الصوديوم₃ ، 1 هيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ و 11 جلوكوز في الماء منزوع الأيونات ، غاز ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂/95٪ O₂إلى درجة حموضة 7.4. قم بتأكيد المقاومة الفعلية باستخدام القراءة الموجودة على المثقب الكهربائي.
      ملاحظه: كلما كان طرف الماصة أكثر حدة ، زادت المقاومة الكهربائية. يجب أن تكون مقاومة الماصة أقل من 10 MΩ. غالبا ما تسد الماصات الزجاجية ذات المقاومة العالية للماصة (الشكل 1 ب) عند الطرف أثناء التثقيب الكهربائي المتكرر.

< p style="الهامش الأيسر:1in;">

< p class = "jove_title" >4. إعداد جهاز التثقيب الكهربائي

1. قم بتثبيت المثقب الكهربائي على جهاز الفيزيولوجيا الكهربية للخلية الكاملة القياسي ، المجهز بمجهر عمودي مثبت على طاولة نقل مع معالج دقيق ومضخة تمعجية.
2. قم بتثبيت مسرح رأس المثقب الكهربائي على جهاز معالجة دقيقة وقم بتوصيل زوج من مكبرات الصوت بجهاز الثقب الكهربائي. قم بتوصيل المثقب الكهربائي بدواسة القدم التي يمكن استخدامها لإرسال نبضة عندما تكون جاهزا.
   ملاحظه: تصدر مكبرات الصوت نغمة عند تشغيلها ، وهو مؤشر على المقاومة الكهربائية عند القطب. هذا يجعل من الممكن تحديد التغيرات النسبية في المقاومة دون لفت الانتباه بعيدا عن الإجراء.

< p class = "jove_title" >5. تحضير التثقيب الكهربائي

1. انقل إدخالات مزرعة الشرائح من أطباق 6 آبار إلى أطباق بتري مقاس 3 سم محملة ب 900 ميكرولتر من وسائط الاستزراع وخزنها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ على الطاولة حتى تصبح جاهزة لإجراء التثقيب الكهربائي.
   1. قم باحتضان إدخالات المزرعة الطازجة مسبقا باستخدام وسائط زراعة الشرائح (1 مل) لمدة 30 دقيقة على الأقل في طبق بتري مقاس 3.5 سم لزراعة الشرائح بعد التثقيب الكهربائي.
2. قم بتنظيف وإعداد الحفارة للتثقيب الكهربائي.
   1. قم بتبييض الخطوط باستخدام مبيض بنسبة 10٪ لمدة 5 دقائق لتعقيم الأنبوب والغرفة قبل بدء التجربة لهذا اليوم.
   2. قم بنفخ الخطوط بالماء المعقم منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة على الأقل لشطفها تماما.
   3. قم بدمج الخطوط باستخدام aCSF المعقم بالترشيح الذي يحتوي على 0.001 ملي مولار من السموم الرباعية (TTX).
      ملاحظه: يقلل TTX من السمية الخلوية والموت بسبب الإفراط في إثارة الخلايا العصبية الداخلية.
3. اضبط معلمات نبض المثقر الكهربائي: سعة -5 فولت ، نبضة مربعة ، قطار 500 مللي ثانية ، تردد 50 هرتز ، وعرض نبضة 500 ميكرو ثانية.
4. املأ الماصة الزجاجية ب 5 ميكرولتر من المحلول الداخلي المحتوي على البلازميد.
   1. قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة من طرف الماصة عن طريق النقر فوقه والنقر عليه برفق عدة مرات.
   2. افحص الطرف بحثا عن التلف عن طريق تصوره تحت مجهر التشريح أو بتكرار الخطوة 3.3.1 للتحقق من مقاومة الماصة.
      ملاحظه: في حالة تلف الطرف، يجب التخلص من الماصة الزجاجية، ويجب تكرار هذه الخطوة باستخدام ماصة زجاجية جديدة تم إعدادها مسبقا في الخطوة 3.
5. قم بتوصيل طرف الماصة بإحكام بالقطب الكهربائي وقم بتشغيل مكبرات الصوت. سجل قراءات (مقاومة الماصة) للمثقب الكهربائي عندما يتلامس الطرف مع وسط aCSF.
6. قم بقص غشاء إدخال المزرعة باستخدام شفرة حادة وعزل مزرعة شريحة واحدة. انقل ثقافة الشريحة بعناية إلى غرفة التثقيب الكهربائي باستخدام ملقط بزاوية حادة وقم بتثبيت موضعها باستخدام مرساة شريحة.
   1. لا تحتفظ بزراعة الشرائح خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة في المرة الواحدة لمنع الآثار الجانبية مثل التغيرات في صحة الخلايا العصبية أو وظيفتها.

< p style="الهامش الأيسر:1in;">

< p class = "jove_title" >6. الخلايا الكهربائية ذات الأهمية

1. قم بالضغط الإيجابي على الماصة بالفم أو باستخدام حقنة سعة 1 مل (ضغط 0.2-0.5 مل) متصلة بالأنبوب.
2. استخدم أدوات التحكم في مقبض الماصة ثلاثية الأبعاد للمشغل الدقيق لمناورة طرف الماصة بالقرب من سطح ثقافة الشرائح.
3. اختر خلية مستهدفة واقترب منها ، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل غمازة على سطح الخلية ، مرئية على المجهر.
4. أداء دورات الضغط.
   1. قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف بسرعة عن طريق الفم بحيث يتشكل مانع تسرب فضفاض بين طرف الماصة وغشاء البلازما، يشار إليه بصريا بواسطة الغشاء الذي يرتفع إلى طرف الماصة إلى حد ما. لاحظ زيادة (~2.5 ضعف المقاومة الأولية) في مقاومة الماصة من خلال الاستماع إلى زيادة النغمة القادمة من مكبرات الصوت. أعد الضغط الإيجابي بسرعة حتى تتشكل الدمل مرة أخرى.
   2. أكمل على الفور دورتين أخريين على الأقل من الضغط دون توقف مؤقت ، ثم استمر في الضغط السلبي لمدة 1 ثانية < / > ملاحظه: يمكن أن يؤدي التوقف المؤقت بين الدورات أو الضغط الشديد أو الضغط السلبي لفترة طويلة إلى تلف كبير للخلايا وربما يتسبب في موت الخلية أثناء التثقيب الكهربائي.
5. قم بنبض المثقب الكهربائي بسرعة مرة واحدة باستخدام دواسة القدم عندما تصل نغمة السماعات إلى قمة ثابتة في الملعب ، مما يشير إلى ذروة المقاومة الكهربائية. لا تنتظر عند ذروة المقاومة لأكثر من 1 ثانية قبل إرسال النبض.
   ملاحظه: لم نلاحظ أي تثقيب كهربائي خارج الهدف عند استخدام هذا البروتوكول. تم نقل الخلايا الملامسة للماصة الزجاجية فقط أثناء دورات الضغط. لا يؤدي وضع الماصة بالقرب من الخلايا العصبية الأخرى إلى تعداء الجينات.
6. اسحب الماصة برفق على بعد 100 ميكرومتر تقريبا من الخلية دون الضغط عليها.
7. أعد تطبيق الضغط الإيجابي ، وتحقق من أن المقاومة مشابهة للقراءة المسجلة في الخطوة 5.5 ، ثم اقترب من الخلية التالية.
   1. قم بإزالة السدادات المحتملة، المشار إليها بصريا أو بزيادة كبيرة (أعلى بنسبة >15٪) في مقاومة الماصة بعد التثقيب الكهربائي، عن طريق الضغط الإيجابي.
      ملاحظه: إذا لم يكن هناك انسداد مرئي وكانت المقاومة لا تزال أعلى بكثير، فتخلص من الماصة واستخدم ماصة جديدة. في المتوسط، يمكن استخدام الماصة لما يصل إلى 20 حدثا للتثقيب الكهربائي إذا كان المستخدم حريصا.

بعد التثقيب الكهربائي ، انقل ثقافة الشريحة إلى ملحق مزرعة جديد ، واحتضنه عند 35 درجة مئوية في الحاضنة لمدة تصل إلى 3 أيام.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: صورتان تمثيليتان للماصة الزجاجية. (أ) عرض ماصات أقل مقاومة (6.5 MΩ)، مستخدمة في هذا البروتوكول، و (ب) ماصات ذات مقاومة أعلى (10.4 MΩ) نموذجية لبروتوكولات التثقيب الكهربائي.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: تم تزويد مزار...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تحضير البلازميد طقم تنقية البلازميد كياجين هاتف 12362 تحضير ثقافة الشرائح العضوية 6 أطباق جيدة غرينر بيو ون 657160 دومون # 5/45 ملقط FST #5/45 ملقط تشريح بزاوية لتحضير ثقافة الشرائح العضوي وحدة تصفية القارورة ميليبور SCHVU02RE ترشيح وتخزين وسائط الاستزراع حاضنه الموثق دينار بحريني C150-UL ماكلوين مروحية مناديل تيد بيلا ، إنك. 10180 مفرمة مناديل لإعداد ثقافة الشرائح العضوية إدراج ثقافة الخلايا Millicell، 30 مم ميليبور PIHP03050 إدراج ثقافة الشرائح العضوية مقياس التناضح أنظمة الدقة OSMETTE II ملاعق مطلية ب PTFE كول بارمر سك - 06369-11 مقص FST 14958-09 مجهر ستيريو أوليمبوس ش.ز61 نظام ترشيح الفراغ المعقم ميليبور SCGPT01RE ترشيح وتخزين aCSF تحضير القطب الكهربائي نظارات شعرية وارنر إنسترومنتس 640796 مجتذب Micropipetter أداة سوتر ف -1000 ساحبه فرن الموثق دينار بحريني (E2) خيوط مجتذب أداة سوتر FB330B ساحبه أطباق فالكون بتري 3.5 ملم بي دي فالكون 353001 منضدة TMC 63-7512 [إ] كاميرا CCD تصوير Q ريتيجا -2000 تيار مستمر كاميرا نظام التثقيب الكهربائي الأجهزة الجزيئية Axoporator 800A المثقاب الكهربائي نظام إضاءة التألق قبل التجويف 200 مناور أداة سوتر MPC-385 مناور برنامج Metamorph الأجهزة الجزيئية الحصول على الصور مضخة تمعجية رينين ديناماكس ، RP-2 مضخة التروية طاولة التحول لويجز ونيومان 240 س س سماعة مجهول مكبرات صوت متصلة بجهاز التثقيب الكهربائي مجهر ستيريو أوليمبوس 30 ش.س حاضنة سطح الطاولة الترمو: العلمية ميدي 40 مجهر عمودي أوليمبوس BX61WI