عزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي: إجراء تدرج الكثافة لعزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي لحديثي الولادة للدراسات في المختبر

ملخص

[تدرج FIGURE1 هنا]

الشكل 1: تشريح العمود الفقري وإطلاق الحبل الشوكي من فأر حديث الولادة يبلغ من العمر 3 أيام. يشير السهم الموجود في (أ) إلى الطرف الذيلي للعمود الفقري ، حيث يتم إدخال إبرة لتحرير الحبل الشوكي. يظهر الحبل الشوكي المطلق (ب) مغمورا في PBS.

[تدرج FIGURE2 هنا]

الشكل 2: تدرج الكثافة ، مع إضافة الخلايا بعد الطرد المركزي. يتم تحديد الطبقات وتصورها بشكل أفضل في تصوير الرسوم المتحركة. الطبقة الأكثر سطحية (0) هي بشكل عام حطام من أنسجة الحبل الشوكي. الطبقة 1 غنية بالخلايا قليلة التغصن والخلايا النجمية. تحتوي الطبقتان 2 و 3 على غالبية الخلايا العصبية. بينما تحتوي الطبقة 3 على خلايا عصبية ذات أعلى نقاء ، توجد بعض الخلايا الداعمة (مثل الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن) في الطبقة 2. تحتوي الحبيبات الموجودة في الأسفل بشكل أساسي على خلايا دبقية صغيرة.

الملخص

المصدر: Eldeiry، M. et al. عزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي وثقافته من الفئران حديثي الولادة.

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي من فأر حديثي الولادة للدراسات في المختبر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. حصاد الحبال الشوكية

ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات (135 درجة مئوية و 30 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 4 × 7 دقائق) للعقم.

قتل جراب
1. الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 1-3 أيام في غرفة مع الأيزوفلوران. انتظر 30 ثانية بعد توقف الحركة واضغط على الساق لتأكيد عدم الاستجابة.
2. افصل الرأس عن الجسم باستخدام المقص ، مع وضع الجرو في وضع الانبطاح.
3. ثبت الساقين الخلفيتين أو الذيل والذراعين على طاولة الإجراءات، بحيث يكون الجانب الظهري مواجها للمستخدم.
4. قطع الجلد باستخدام مقص القزحية المنحني.
5. اقطع الحبل الشوكي من منطقة أسفل الظهر فوق الوركين مباشرة واستمر في قطع جانبي الصدر لفصله عن الجسم.
   ملاحظه: يتطلب ذلك تشريحا دقيقا للحبل الشوكي من الأعضاء الحشوية لتجنب الضرر غير المقصود للأعضاء الأخرى (الشكل 1 أ).
6. يغسل بالتتابع لمدة 10 ثوان في أطباق بتري مقاس 3 × 10 سم تحتوي على 5 مل من محلول ملحي معقم بالفوسفات بفلتر (PBS) سعة 0.2 ميكرومتر لإزالة الأنسجة الزائدة.
7. أدخل إبرة وحقنة 22G مملوءة ب 5 مل من PBS المعقم بالترشيح في الطرف الذيلي للعمود الفقري وقم بغسلها في الجمجمة ، مما يسمح للسلك بالخروج إلى طبق بتري الرابع (الشكل 1 ب).
8. اجمع الحبل الشوكي في أنبوب سعة 15 مل مع 5 مل من HABG (الجدول 1) على الجليد. توخي الحذر لتجنب سحق الحبل الشوكي.
9. كرر الخطوات من 1.1 إلى 1.8 لكل جرو في القمامة.
   ملاحظه: من الناحية المثالية ، يجب أن تستغرق هذه العملية أقل من 30 دقيقة لكل حبل شوكي لضمان عزل الخلايا العصبية بشكل صحي.

< p class = "jove_title" >2. عزل الخلايا العصبية

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة التالية في غطاء التدفق الصفيحي. من المتوقع الإلمام بتقنية التعقيم الأساسية.

1. فرم الأنسجة
   1. خذ الأنبوب الذي يحتوي على الحبل الشوكي ورجه برفق لتعليق الأنسجة.
   2. صب المناديل من الأنبوب في طبق بتري زجاجي مقاس 60 مم وقم بتقطيعه بشفرة حلاقة لإنشاء قطع دقيقة بحجم ~ 0.5 مم.
   3. انقل الأنسجة بماصة عريضة التجويف إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من HABG.
   4. ضعه في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالتوازن عند درجة الحرارة هذه. احتفظ بالخلايا على شاكر بما يكفي للسماح لها بتعليقها في السائل.
      ملاحظه: تتم هذه الخطوة لتجنب صدمة الخلايا عند نقلها من الجليد إلى وسط الهضم. يساعد الحفاظ على الخلايا عند 30 درجة مئوية على تقليل موت الخلايا المرتبط بزيادة التمثيل الغذائي عند 37 درجة مئوية.
2. تحضير وسط الهضم (الجدول 1).
3. تحضير تدرج الكثافة (الجدول 1).
   1. قم بإعداد كل طبقة من الطبقات الأربع في 4 أنابيب منفصلة سعة 15 مل ، كما هو موضح في الجدول 1.
   2. أضف 1 مل من كل طبقة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. ابدأ بالطبقة 1 في الأسفل وأضفها بالتتابع حتى تصل إلى الطبقة 4 في الأعلى. تجنب إزعاج الطبقات أثناء الإضافة.
4. اغسل الألواح المطلية ب PDL. اغسلها بالماء المعقم لبضع دقائق قبل إزالة أي ماء متبقي واتركها تجف لمدة 1 ساعة.
5. انقل الأنسجة إلى وسط الهضم.
   1. قم بإزالة الأنبوب المحتوي على المناديل من حمام ماء الخلط عند 30 درجة مئوية واتركه يستقر لبضع دقائق.
   2. قم بإزالة أنبوب وسط الهضم من الحمام المائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وشفطه في حقنة قفل لور.
   3. استنشق HABG الزائد من الأنبوب المحتوي على الأنسجة.
   4. استخدم مرشح leur-lock 0.2 μm على المحقنة لإضافة وسط الهضم إلى الأنبوب المحتوي على الأنسجة.
   5. ضع الأنبوب في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حافظ على اهتزاز الخلايا بما يكفي للسماح بتعليقها في السائل.
      ملاحظه: من المهم عدم إبقاء الخلايا في وسط الهضم لفترة طويلة جدا أو ترك درجة الحرارة ترتفع بشكل كبير ، مما قد يؤدي إلى الهضم المفرط ويؤدي إلى تعليق الأنسجة في خليط هلامي.
6. خلال هذه الفترة ، قم بتغطية اللامينين.
7. إجراء التجربة (أي فصل الخلايا عن الأنسجة).
   1. قم بإزالة الأنبوب من الحمام المائي المهتز 30 درجة مئوية واتركه يستقر لبضع دقائق.
   2. شفط وسط الهضم الزائد.
   3. الأنسجة في 2 مل من HABG.
   4. باستخدام ماصة ضيقة التجويف، قم بترتيبات 10x لمدة 45 ثانية
      ملاحظه: ربما تكون هذه هي الخطوة الوحيدة الأكثر أهمية ويمكن أن تقلل بشكل كبير من العائد إذا لم يتم القيام بها بشكل صحيح.
      1. قم بشفط الأنسجة في الماصة وأفرغ المحتويات على الفور مرة أخرى.
      2. تجنب إدخال الهواء ، لأنه سيقلل بشكل كبير من العائد القابل للحياة.
         ملاحظه: الماصة المثالية هي ماصة زجاجية مقاس 9 بوصات. يجب أن يكون طرف الماصة مصقولا بالنار لتنعيم الأسطح الخشنة. يجب بعد ذلك أن يتم سيليكونها عن طريق وضعها في محلول 1:20 من ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان (DMDCS) في الكلوروفورم وترك O / N. يجب بعد ذلك إزالة الماصة وتركها تجف في الهواء. بعد ذلك ، يجب تعقيمها للتعقيم.
         أنذر: DMDCS والكلوروفورم قابلان للاشتعال بدرجة كبيرة ، ويجب أن يتم السيليكون في غطاء الدخان.
   5. استنشق أعلى 2 مل من المادة الطافية وضعها في أنبوب جديد سعة 15 مل يسمى "مجموعة".
   6. كرر الخطوات 2.7.3-2.7.5 مرتين إضافيتين (يجب أن يحتوي أنبوب تجميع الخلايا على 6 مل في النهاية).
   7. انقل محتويات أنبوب التجميع ببطء إلى أنبوب التدرج المحضر في الخطوة 2.2 ، وتجنب تعطيل التدرج.
8. في هذه المرحلة ، قم بإزالة الوسط العصبي القاعدي المعد مسبقا (الجدول 1) من الثلاجة واتركه يسخن في حمام 37 درجة مئوية.
9. تنقية الخلايا العصبية.
   1. جهاز الطرد المركزي أنبوب التدرج لمدة 15 دقيقة عند 800 × جم و 22 درجة مئوية.
   2. اجمع الطبقة (الطبقات) المرغوبة باستخدام ماصة (الشكل 2) وضعها في أنبوب جديد سعة 15 مل. لعزل الخلايا العصبية الأعلى نقاء (أي >90٪) ، اجمع الطبقة 3. لمزيد من الغلة مع نقاء أقل (أي >70-80٪) ، اجمع الطبقتين 2 و 3.
   3. قم بتخفيف تدرج الكثافة بإضافة 5 مل من HABG إلى الطبقات التي تم جمعها حديثا.
   4. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية.
   5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 5 مل من HABG ، ونفض الغبار عن الحبيبات لتعليق الخلايا.
   6. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية.
   7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 3 مل من الوسط العصبي القاعدي ، ونفض الغبار عن الحبيبات لإعادة تعليق الخلايا.

وسائط خزن المكونات اعداد HABG 4 درجة مئوية / 24 ساعة 100 مل - قم بإذابة الثلج B27 في ثلاجة 4 درجات مئوية O / N
- تعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) السبات أ 97.8 مل B27 [2٪] 2 مل جلوتاماكس [0.5 ملم] 0.25 مل الوسائط العصبية القاعدية 4 درجة مئوية / 1 أسبوع 100 مل - قم بإذابة الثلج B27 في ثلاجة 4 درجات مئوية O / N
- تعقيم الترشيح (0.22 ميكرومتر)
- أجزاء Aliquot 50 مل في أنابيب 50 مل (تخزينها في 4 درجات مئوية) العصبي أ 97 مل B27 [2٪] 2 مل جلوتاماكس [0.5 ملم] 0.25 مل القلم / البكتيريا العقدية [1٪] 1 مل وسائط الهضم يوم العزل 10 مل - رج العبوة بقوة
- اتركه في حمام 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (يتم تحضيره بشكل مثالي قبل 30 دقيقة من الاستخدام)
- تعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) HA-Ca 10 مل غراء < TD Colspan = "2" >25 مجم جلوتاماكس [0.5 ملم] 0.025 مل تدرج الكثافة يوم العزلة 1 التدرج طبقة أوبتي بيرب هابج (0.13 مل) (5.29 مل) 1 أسفل 0.26 مل 1.24 مل 2 0.19 مل 1.31 مل 3 0.15 مل 1.35 مل 4 أعلى 0.11 مل 1.39 مل

الجدول 1: إعداد الوسائط والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تشريح العمود الفقري وإطلاق الحبل الشوكي من فأر حديث الولادة يبلغ من العمر 3 أيام. يشير السهم الموجود في (أ) إلى الطرف الذيلي للعمود الفقري ، حيث يتم إدخال إبرة لتحرير الحبل الشوكي. يظهر الحبل الشوكي المطلق (ب) مغمورا في PBS.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد