عزل الحليمات المحيطة (CVP) بالظهارة من نموذج الفأر: إجراء إنزيمي لفصل ظهارة CVP عن لسان الفأر

الملخص

المصدر: Shechtman ، L. A. et al. توليد وثقافة العضيات اللغوية المشتقة من الخلايا الجذعية لطعم الفأر البالغ. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نصف عزل ظهارة الحليمات المحيطة (CVP) من لسان الفئران.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل الظهارة CVP

1. قتل الفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون₂ وفقا للوائح IACUC ، متبوعة بطريقة ثانوية معتمدة مثل بضع الصدر الثنائي أو خلع عنق الرحم أو قطع الرأس أو الاستئصال.
2. استخدم مقص تشريح معقم كبير لقص الخدين وكسر الفك. ارفع اللسان واقطع اللجام اللساني لفصل اللسان عن أرضية تجويف الفم. اقطع اللسان واجمعه في محلول ملحي معقم بارد بالفوسفات من Dulbecco (dPBS) مع Ca²⁺ و Mg²⁺.
3. قم بإزالة اللسان الأمامي والتخلص منه عن طريق قطع الجزء الأمامي من الصدارة بين الضخار بشفرة حلاقة (الشكل 1 أ ، خط متقطع). استخدمي مناديل دقيقة لإزالة أي شعر وسوائل زائدة من اللسان الخلفي.
4. املأ حقنة 1 مل ب 200-300 ميكرولتر من محلول إنزيم الحقن (التركيز النهائي: 2 مجم / مل من النوع الأول كولاجيناز و 5 مجم / مل Dispase II بأسلوب Ca^{2 +} / Mg^{2 +} - يحتوي على dPBS ، مخفف من محاليل مخزون 10 مجم / مل) وأدخل إبرة 30 جم × 1/2 فوق السمو بين الضريحات مباشرة (الشكل 1 ب ، السهم الأسود) حتى الجزء الأمامي من CVP (الشكل 1 ب ، الصندوق الأسود). حقن محلول الإنزيم أسفل وعند الحواف الجانبية ل CVP بين الظهارة والأنسجة الأساسية (الصفيحة المخصوصة ، العضلات). اسحب المحقنة ببطء وبشكل مستمر من اللسان أثناء إجراء الحقن.
5. احتضان اللسان بأسلوب Ca^{2 +} / Mg ^{2 +} dPBS خال من درجة حرارة الغرفة لمدة 33 دقيقة بالضبط.
6. قم بعمل جروح صغيرة في الظهارة بشكل ثنائي وأمام CVP باستخدام مقص تشريح دقيق للغاية ، وقشر الظهارة برفق عن طريق رفعها بالملقط الدقيق. بمجرد أن تصبح ظهارة الخندق خالية من النسيج الضام الأساسي ، ضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 2 مل مغطى مسبقا ب FBS. قم بالتشذيب الظهاري قبل أو بعد فصل ظهارة CVP (الشكل 1 ج ، د).

النتائج

الشكل 1: تشريح اللسان وظهارة CVP المقشرة. (أ) يتم تشريح اللسان ، وإزالة اللسان الأمامي عن طريق قطع الجزء الأمامي من الصدارة بين الضخار (الخط المتقطع) ، تاركا اللسان الخلفي ، والذي يتضمن CVP (الصندوق الأسود) (ب) يتم إدخال إبرة أمام الصدارة بين الضخار (السهم الأسود) ، ويتم حقن خليط الإنزيم أسفل وإلى الحواف الجانبية ل CVP (الصندوق الأسود). (ج

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل حقنة TB حقنة BD 309659 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع Ca²⁺ & Mg²⁺ جيبكو 10010-023 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مع Ca²⁺ & Mg²⁺ سيجما لعلوم الحياة د8662-500 مل دومون # 5 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11252-30 مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو هاتف: 26140-079 1 مل حقنة TB حقنة BD 309659 2.0 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1420-2700 مقص جراحي - شارب أدوات العلوم الدقيقة 14002-14 مقص بون فائق الدقة أدوات العلوم الدقيقة 14084-08 مؤقت / ساعة توقيت كبيرة الأرقام فيشر ساينتيك S407992 مجهر مجسمة زييس ستيمي SV6 كوهان فاناس مقص الربيع أدوات العلوم الدقيقة 15000-02 كولاجيناز من المطثية النسائية ، النوع الأول سيجما لايف ساينس C0130-1G Dispase II (البروتياز المحايد ، الدرجة الثانية) سيجما ألدريتش (روش) 4942078001