Method Article

حقن الفقاعات الدقيقة في أجنة الفئران المعزولة: تقنية لتوصيل عوامل تباين الفقاعات الدقيقة إلى الأوعية الدموية لأجنة الفئران الحية

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Denbeigh ، J. M. et al. تصوير التباين في أجنة الفئران باستخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو إجراء لحقن عوامل تباين الفقاعات الدقيقة في جنين فأر معزول في مرحلة الحمل المتأخرة. يساعد التصوير بالموجات فوق الصوتية القائم على عامل تباين الفقاعات الدقيقة على تصور وتوصيف البيئة الوعائية للجنين.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الفقاعات الدقيقة

  1. تحضير الفقاعات الدقيقة للحقن
    ملاحظه: يقوم المساعد بهذه الخطوة عند بدء "حقن الفقاعات الدقيقة (MB) في الأجنة". يتم حقن كل جنين مرة واحدة ، مع اختيار نوع الفقاعات الدقيقة المختارة لكل حقنة بشكل عشوائي من قبل المساعد بحيث يتم توزيع جميع أنواع الفقاعات الدقيقة بالتساوي طوال الإجراء ولكن يتم إعطاؤها بترتيب عشوائي. تأكد من أن الجراح أعمى عن نوع الفقاعة التي يتم حقنها.
    1. حدد حجم محلول فقاعة المخزون المطلوب لإنتاج تركيز نهائي 1 × 108 ميجابايت / مل بحجم 400 ميكرولتر (احسب الحجم باستخدام تركيزات المخزون). Aliquot الحجم المقابل من المحلول الملحي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق فارغ.
    2. حرك قارورة الفقاعات الدقيقة المحددة برفق وارسم حجما زائدا (~ 50 ميكرولتر أكبر من ذلك المحسوب أعلاه) من المحلول في حقنة سعة 1 مل باستخدام إبرة 21 جرام. حقن الفقاعات الدقيقة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ.
    3. ماصة الحجم اللازم لمحلول مخزون الفقاعات الدقيقة وإضافة إلى كمية المحلول الملحي. تخلط عن طريق التقليب برفق بطرف الماصة.
    4. ارسم محلول الفقاعات الدقيقة المخفف في حقنة نظيفة باستخدام إبرة 21 جرام. إزالة الإبرة ، وإزالة أي فقاعات هواء من المحقنة وإرفاق اللور والأنبيب. ادفع المحلول ببطء إلى نهاية الأنبوب مع التأكد من عدم توليد أي فقاعات هواء.
    5. أدخل المحقنة في مضخة ضخ حقنة مضبوطة لتوزيع الفقاعات الدقيقة بمعدل 20 ميكرولتر / دقيقة لحجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر. حرك المضخة بالقرب من مرحلة الحقن.
< p class = "jove_title" >2. حقن الفقاعات الدقيقة في الأجنة

  1. حدد بشكل عشوائي وقم بإزالة جنين واحد (بملعقة مثقبة) من طبق الوسائط المبرد. ضعه في طبق تشريح موجود في مرحلة الموجات فوق الصوتية تحت المجسم وقم بإزالة كيس الصفار والأغشية السلوية بالملقط الدقيق ، مع القطع / التمزيق من الجانب الذي يبدو أقل وعائية (الجانب التجريبي). يتم تحقيق ذلك بسهولة أكبر عن طريق ثقب منطقة مجاورة لمنطقة الرأس.
    1. قطع بما يكفي لإزالة الجنين من الداخل ، ولكن ليس أكثر. قم بتثبيت أطباق التشريح باستخدام قطع صغيرة من البلاستيسين.
  2. قم بمناورة الكيس برفق من حول الجنين. ضع الجنين على جانبه ، مع وضع المشيمة والأوعية السرية في المقدمة. باستخدام دبابيس الحشرات ، قم بتثبيت كيس الصفار (يوصى باستخدام 4 دبابيس) وحواف المشيمة حسب الضرورة لتثبيتها في مكانها. تجنب السفن الرئيسية.
  3. اغسل الجنين ب 45 درجة مئوية PBS الدافئ مسبقا حتى ينتعش الجنين. تحديد الوريد السري وشبكة الأوعية الدموية المرتبطة به. ضع الطبق بحيث يمكن إجراء الحقن بشكل مريح. < / > ملاحظه: بمجرد تسخينه ، سيبدأ الدم في الجنين في التدفق ، ويضخ بشكل واضح في الشريان السري. عندما يبدأ التدفق لأول مرة ، ستكون الأوردة حمراء زاهية ، مع ظهور الدم في كلا الوعاءين متطابقا بسرعة. عادة ما تتراكب الفروع الناشئة عن الوريد السري تلك الموجودة في الشريان السري على سطح المشيمة.
  4. بمجرد إحياء الجنين ، قم بتغطيته (ولكن ليس المشيمة) بهلام أمريكي دافئ مسبقا ، مع التأكد من إزالة أي فقاعات هواء بدقة (باستخدام الملقط الدقيق) من حول الجنين. قم بتعبئة الطبق ب PBS الدافئ مسبقا.
    ملاحظه: راقب مستوى المحلول في محاقن PBS والهلام وأضف محاقن احتياطية إلى دورق التسخين حسب الحاجة.
  5. قم بتركيب الإبرة الزجاجية على كرة كبيرة من البلاستيسين على حافة طبق التشريح وأدخل طرف الإبرة في PBS. اختيار الوريد على السطح المشيمي لقرص المشيمة ، بعيدا عن الفرع الرئيسي بقدر ما هو معقول ، قم بقص الطرف حسب الحجم باستخدام المقص. يكون الحقن أسهل إذا تم قطع الطرف بزاوية طفيفة. قم بإزالة أي حواف خشنة للزجاج باستخدام حافة مقص الزنبرك.
  6. باستخدام مضخة الحقنة ، قم بحقن محلول الفقاعات الدقيقة ببطء عند 20 ميكرولتر / دقيقة في الإبرة الزجاجية حتى يتم طرد كل الهواء من طرف الإبرة ويمكن رؤية الفقاعات الدقيقة تتدفق بحرية إلى PBS. أوقف المضخة وأعد ضبطها لحجم حقن يبلغ 20 ميكرولتر. لا تسمح للهواء بدخول نظام الأوعية الدموية للجنين أثناء الحقن.
  7. أدخل طرف الإبرة الزجاجية برفق في أحد الأوردة في المشيمة وتأكد من أنها غير متحركة. قم بتأرجح رأس المجسم بعيدا وضع محول الطاقة فوق الجنين. بدء التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments جليد 0.9٪ كلوريد الصوديوم (محلول ملحي) هوسبيرا 0409-7984-11 محلول ملحي مخزن بالفوسفات [1x] سيغما د8537 1x ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم عامل تباين بالموجات فوق الصوتية ، جاهز للهدف وغير مستهدف مايكروماركر. شركة VisualSonics جل الموجات فوق الصوتية (Aquasonic 100 ، عديم اللون) CSP الطبية 133-1009 دلو الثلج كول بارمر RK 06274-01 منصة التصوير شركة VisualSonics نظام السكك الحديدية المتكامل مصدر الضوء ، الألياف البصرية فيشر ساينتيك 12-562-36 من الناحية المثالية لديه أذرع قابلة للتعديل لوير (12) ، أنثى شائكة من مادة البولي بروبلين 1 / 4-28 خيط UNF كول بارمر 45500-30 نظام الموجات فوق الصوتية الدقيقة ، عالي التردد شركة VisualSonics فيفو2100 الإبر ، مقياس 21 (1 بوصة) VWR 305165 ملعقة مثقبة (موريا) أدوات العلوم الدقيقة MC 17 10373-17 دبابيس (6) ، دقيقة بأكسيد أسود 0.15 مم أدوات العلوم الدقيقة 26002-15 المحاقن ، 1 مل Normject صياد 14-817-25 مضخة ضخ الحقنة الوشق الحيوي NE-1000 الماصات [2-20 ميكرولتر، 20-200 ميكرولتر، 100-1,000 ميكرولتر] إيبندورف Research Plus قابل للتعديل
3120000038;
3120000054;< br /> 3120000062 أطراف الماصات [2-200 ميكرولتر، 50-1,000 ميكرولتر] إيبندورف EPT.i.p.s.
22491334;< /> 022491351 مقص الشعيرات الدموية الزجاجية ، 1 × 90 مم GD-1 مع خيوط ناريشيجي جي دي -1 مجتذب إبرة زجاجية ناريشيجي PN-30 أنابيب ، إيبندورف VWR 20170-577 رفوف أنبوبية (3) VWR 82024-462 صفيحة ساخنة VWR 89090-994 محاقن (10) ، 30 مل VWR CA64000-041 محول الموجات فوق الصوتية ، 20 ميجا هرتز شركة VisualSonics إم إس 250

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbubble InjectionMouse EmbryosUltrasound ImagingContrast AgentsVascular DeliverySyringe PumpGlass NeedleEndothelial TargetingHigh frequency UltrasoundPlacental Disc

Related Articles