تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. إعداد مسحة العين ، وإعداد مجال العمل ، ومسح عين الفأر وإثراء العينة
- تحضير مسحات العين المعقمة
ملاحظه: مسحات العين المعقمة عبارة عن أعواد أسنان خشبية مطلية بطبقة رقيقة من الألياف القطنية ومصنوعة في المنزل.
- الأوتوكلاف كمية مناسبة من القطن وأعواد الأسنان لعدد الفئران المراد مسحها.
- اقرص قطعة قطنية بطول نصف سنتيمتر بالإبهام والسبابة. قم بإثارة الضرب عن طريق سحب الحواف بالإبهام والسبابة لتشكيل طبقة مسامية مسطحة ، والتوقف قبل أن ينهار الضرب مباشرة (قطع صغيرة من القطن منتشرة في جميع أنحاء الضرب الممتد مقبولة).
- قم بتدوير الضرب حول أحد الأطراف الحادة لعود الأسنان عن طريق إمساك القطعة الممتدة برفق على طرف المسواك لأنها ملتوية ، انظر الشكل 1. تحتوي مسحة العين "المكتملة" على طبقة رقيقة جدا من القطن ممتدة فوق الحافة ، وتمتد حوالي نصف إلى سنتيمتر واحد بعيدا عن الحافة.
- أدخل المسحات "المكتملة" في دورق صغير ، وجانب المسحة لأسفل وقم بتغطيته. الأوتوكلاف.
- إعداد مساحة العمل
- تحضير التخدير الذي يحتوي على 2 مل من الكيتامين (100 مجم / مل) و 400 ميكرولتر من الزيلازين (100 مجم / مل) و 27.6 مل من محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم في dH₂O) في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. تعقيم الفلتر والتخدير للاستخدام الفوري (يمكن تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد ؛ اترك دائما التوازن مع درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام).
- نظف ونظف منطقة العمل بمطهر لتقليل التلوث.
- Aliquot 0.5 مل من وسائط ضخ القلب الدماغ المعقمة (BHI) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة 1.5 مل (أنبوب واحد لكل فأر ومراقبة) ؛ رتب في رف الطرد المركزي الدقيق. ضع الرف على الجليد.
- قم بإعداد تدفق العمل على النحو التالي (من اليسار إلى اليمين): محطة تخدير الفأر (قفص يحتوي على فئران تجريبية ، قفص معقم فارغ ، تخدير بدرجة حرارة الغرفة ، إبرة 25 جم وحقنة 1 مل) ، محطة مسح العين (BHI على الثلج ، مسحات العين المعقمة ، مناشف ورقية نظيفة ، رذاذ الأيزوبروبانول 70٪) ومحطة الطلاء (ألواح أجار الدم بدرجة حرارة الغرفة ، ماصة 10 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر نصائح معقمة يمكن التخلص منها ، حاوية نفايات بيولوجية).
- مسحة العين
- يجب إعطاء 10 ميكرولتر من التخدير لكل 1 جم من وزن الفأر ، وجرعة الكيتامين والزيلازين ، على التوالي داخل الصفاق لكل فأر بالغ ، وضعها في قفص معقم. اختبار التخدير عن طريق الضغط على وسادة القدم الخلفية. لا توجد حركة تشير إلى التخدير المناسب.
- قم بتعيين يد واحدة للتعامل مع الفئران المخدرة فقط واليد الأخرى للتعامل مع مسحة العين والمزرعة فقط. للمسح ، قم بإزالة الفأر المخدر بالكامل من القفص ؛ ضعه فوق سطح العمل النظيف الموضوع على جانبه مع كشوف العين اليسرى. رش اليدين القفازات بالأيزوبروبانول ، وجفف بمنشفة ورقية نظيفة.
- Uncap أنبوب الطرد المركزي الصغير BHI المسمى على وجه التحديد مع يد مخصصة لمعالجة الوسائط. ضع الأنبوب مرة أخرى في رف جهاز الطرد المركزي الصغير على الثلج. اغمس الطرف المطلي بالقطن من مسحة العين في BHI ، واسحب مسحة العين من الأنبوب الذي يحوم الطرف مرتين على الأنبوب الداخلي لإزالة السائل الزائد.
- باستخدام يد التعامل مع الماوس ، أمسك الماوس برفق من قفص الرقبة. من ناحية أخرى ، ضع طرف مسحة العين على منطقة الملتحمة الإنسية للعين اليسرى ، انظر الشكل 2 أ. اضغط برفق على مقلة العين وحرك المسحة في حركة غسل النافذة (الشكل 2 ب) ذهابا وإيابا ، بين الجفن السفلي والعين ، 10 مرات. حافظ على ضغط مستمر.
- دون لمس الفراء ، قم بإزالة طرف المسحة برفق ، بشكل عمودي على المكان الذي تم إدخاله فيه ، وضع جانب قطن المسحة لأسفل مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على وسائط BHI. ضع قطرة عين مزحمة على العين الممسحة.
- أعد الماوس إلى القفص.
- اترك المسحة لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الثلج وقم بإزالة مسحة العين باليد المعقمة التي ترتدي القفاز عن طريق خلط الطرف في الوسائط لمدة 10 دورات. اسحب المسحة عن طريق تدوير الطرف على الجدار الداخلي لأنبوب الطرد المركزي الصغير لمدة 5 دورات. تخلص من المسحة في حاوية بيولوجية.
- كرر الخطوات من 1.3.2 إلى 1.3.7 لكل فأر ولعينات التحكم (مسحة الجلد أو الفراء). عقم القفازات بشكل مناسب بين كل مسحة.
- تخصيب
- قم بإثراء العينة عن طريق احتضان الأنبوب بشكل ثابت لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية
- أثناء الحضانة ، قم بتسمية فول الصويا التربتيكاز بدرجة حرارة الغرفة بنسبة 5٪ من صفيحة أجار دم الأغنام (لوحة TSA) لكل فأر وقسمها إلى نصفين.
- بعد حضانة مزرعة مسحة العين ، قم بإزالة العينات المخصبة من الحاضنة وضعها على الثلج.
- باختصار عينات دوامة لخلطها ووصفها وفقا للتخطيط في الشكل 3 أ. Aliquot 10 ميكرولتر من العينة على لوحة TSA وإمالة اللوحة لتشكيل شريط ، كرر 2 مرات.
- على الجانب الآخر من الخط الفاصل للصفيحة، ضع 10 ميكرولتر من العينة على أجار، وكرر ذلك 9 مرات.
- احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة و 2 أيام و 4 أيام (في غرفة نظيفة تمنع ألواح أجار من الجفاف). عد المستعمرات في شرائح ، ولاحظ مورفولوجيا واحسب وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) لكل مسحة للعزلات المتشابهة شكليا. انظر إلى نقاط الكائنات الحية الفريدة التي لم يتم التقاطها في شرائح.
