نضح القلب الرجعي Langendorff: تقنية Ex Vivo لبث قلب الفأر المعزول

الملخص

المصدر: Wu ، K. et al. تعديلات على طريقة Langendorff للعزل المتزامن للخلايا العضلية الأذينية والبطينية من الفئران البالغة. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء نضح Langendorff إلى الوراء لقلب فأر معزول. أثناء الإجراء ، يتم الحفاظ على نشاط القلب للقلب عن طريق نقعه بأثر رجعي بمحلول التروية عبر الشرايين التاجية باستخدام قنية يتم إدخالها في الشريان الأورطي الصاعد. يستخدم النموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للقلب

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير جهاز المحلول والتروية

1. قم بتجميع جهاز Langendorff ذو التدفق المستمر (متاح تجاريا أو عصامي). يوفر الشكل 1 مخططا بسيطا.
2. قم بإعداد المحاليل وفقا للكواشف الواردة في الجدول 1 والجدول 2.
3. قم بتشغيل الحمام المائي المتداول واضبط درجة حرارة الإدخال المناسبة (42.7 درجة مئوية في مختبرنا) لضمان وصول تدفق نظام دوران التعقيم من القنية إلى 37 درجة مئوية.
4. نظف نظام التروية عن طريق تدوير الماء منزوع الأيونات. إذا كانت هناك حاجة إلى حالة معقمة ، فقم بتشغيل 75٪ من الإيثانول من خلال نظام التروية لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بالماء منزوع الأيونات (10 دورات على الأقل لتجنب آثار سمية الكحول على القلب).
5. قم بقياس الوقت والحجم لدورة واحدة من نظام دوران النفيوم لتحديد عدد المليلتر من محلول Tyrode المؤكسج الذي سيتم تحميله في خطوة التروية التالية.
6. تعقيم جميع الأدوات الجراحية بالطريقة المرغوبة.
7. اضبط معدل تدفق نظام نضح الانخريد على 4 مل / دقيقة.
8. قم بإعداد طبقين نظيفين من بتري مقاس 35 مم - أحدهما يحتوي على محلول Tyrode (طبق بتري 1) ، والآخر يحتوي على محلول 1 (طبق بتري 2).
9. قم بإعداد حقنة سعة 1 مل مملوءة بالمحلول 1 وإبرة قنية فولاذية حادة 20 جم مع شق من حيث المسافة 1 مم إلى الحافة. قم بإعداد عقدة فضفاضة مع خياطة 3-0 لعمود القنية. تنظيم مجال عرض المجهر المجسم وتأكد من أن طرف القنية تحت السطح السائل لطبق بتري 2.

< p class = "jove_title" >2. تحضير

1. يتم تطبيق الهيبارين (تركيز، 1,000 وحدة دولية/مل؛ 0.2 مل/فأر) داخل الصفاق للفئران لتجنب الجلطات الدموية. بعد 10 دقائق ، قم بتخدير الفئران باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم ، حقن IP) وتأكد من توقف الفئران عن الاستجابة لقرصات الذيل / إصبع القدم. إجراء خلع عنق الرحم بعد 20 دقيقة من إعطاء الهيبارين.
2. انقل الفئران إلى المنصة الجراحية ، وقم بتثبيت الفئران في وضع ضعيف ، وتعقيم الصدر بنسبة 75٪ من الإيثانول ، وجففه بشاش أو منديل.

فئة < p = "jove_title" >3. استئصال القلب وقنية الشريان الأورطي

1. ارفع جلد الخنجري باستخدام ملقط الأنسجة وقم بعمل شق جانبي بسيط عبر الجلد باستخدام مقص الأنسجة. قم بإجراء تشريح حاد بين الجلد واللفافة وقم بتمديد شق الجلد على شكل حرف V باتجاه الإبط على كلا الجانبين.
   1. استمر في نفس أثر الشق عبر القفص الصدري ، ثم قم بتحويل القفص الصدري لأعلى عن طريق تثبيت القص بالملقط الأنسجي لكشف القلب والرئتين بالكامل.
2. انزع التامور باستخدام ملقط منحني. قم بتمزيق الغدة الصعترية باتجاه كلا الجانبين بواسطة ملقطين منحنيين إذا كانت تغطي الأوعية الكبيرة. اسحب قاعدة القلب برفق نحو الذيل باستخدام ملقط منحني حتى يمكن رؤية وعاء دموي على شكل حرف "Y" (الشريان الأورطي وشرايين فرعه).
3. للاحتفاظ بأطوال مختلفة من الشريان الأورطي للقنية والمقارنة ، قم بتحويل الشريان الأورطي في الشريان السباتي المشترك الأيسر (الخط الأخضر في الشكل 2) وقطع الشريان العضدي الرأسي في نفس الوقت في بعض الفئران. استكشت عند الشريان الأورطي الصاعد في الفئران الأخرى (الخط الأسود في الشكل 2).
   ملاحظه: بالنسبة لأولئك الجدد في هذا الإجراء ، يمكن أيضا إجراء هذه الخطوة تحت المجهر المجسم.
4. استئصال القلب ، واغمره على الفور في طبق بتري 1 لغسل وضخ الدم المتبقي.
5. انقل القلب إلى طبق بتري 2 وقم بقص أي أنسجة فائضة باستخدام مقص قزحية ناعم إذا لزم الأمر. بالنسبة لأولئك الجدد في هذا الإجراء ، قم بهذه الخطوة تحت المجهر المجسم لتجنب قطع الشريان الأورطي أو هياكل القلب الأخرى عن طريق الخطأ.
6. ادفع المحقنة لطرد فقاعات الهواء قبل قنية الشريان الأورطي. قم بإجراء قنية الشريان الأورطي المرتجع بمساعدة ملقطين مستقيمين للربط (فكين ناعمين) تحت المجهر المجسم. تأكد من أن عملية القنية بأكملها تحت سطح السائل.
7. تجنب اختراق الصمامات الأبهرية واضبط الأعماق على الشريان الأورطي الصاعد (الفأر الذي تم تمرير الشريان الأورطي فيه عند الشريان السباتي المشترك الأيسر) وجذر الأبهر (الفأر الذي تم تمرير الشريان الأورطي إليه عند الشريان الأورطي الصاعد) ، على التوالي.
   ملاحظه: يعرف عمق قنية الشريان الأورطي (يشار إليه ببساطة باسم العمق) على أنه الموضع الذي يكون فيه طرف القنية في الشريان الأورطي أو حيث يتم ربط الشريان الأورطي.
8. اربط الشريان الأورطي بخياطة العقدة المسبقة 3-0 إلى شق القنية. اضغط برفق على محتوى المحقنة لشطف الدم المتبقي.
   ملاحظه: سوف يغادر الدم الشرايين التاجية ويتدفق من الأوردة الظهرية إذا تم وضع العمق بشكل صحيح. سوف يتمدد القلب والزوائد الأذينية وتصبح شاحبة.
9. قم بإزالة القنية وتوصيلها بجهاز Langendorff. مرة أخرى ، احرص على تجنب دخول أي فقاعات هواء إلى القلب.
   ملاحظه: اعلم أن الوقت من بضع الصدر إلى التروية الأولية يجب ألا يتجاوز 5 دقائق.
10. بالنسبة لتروية القلب ، أولا ، محلول Tyrode المؤكسج الأول والبيرفيوز لمدة 10 ثوان تقريبا (حجم السائل الذي يعمل 10 ثوان في النظام المستخدم في هذا البروتوكول هو حوالي 0.7 مل) إذا كان هناك دم متبقي في الأذينين ، ثم انتقل إلى الحل 1. ومع ذلك ، ما عليك سوى استخدام المحلول 1 إذا لم يكن هناك دم متبقي في الأذينين. قم بتفرير القلب لمدة 2 دقيقة تقريبا.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. حلول لعزل CM للفأر البالغ.

حل المحتويات (التركيز النهائي بالملليمول / لتر ، إذا لم يتم تحديده بشكل مختلف) لاحظ محلول التروية (الحل 1) 113 كلوريد الصوديوم ، 4.7 كيلو كلوريد ، 0.6 كيلو ساعة₂PO₄ ، 0.6 Na₂HPO₄ ، 1.2 MgSO₄ ، 12 NaHCO₃ ، 10 KHCO₃ ، 10 HEPES ، 15 تورين ، 5 جلوكوز ، 10 2،3-بوتانيديون مونوكسيم (BDM) والتي يمكن تخزينها لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية ، ويضاف الجلوكوز والتورين و BDM في يوم التجربة. تحضير 200 مل من محلول التروية لكل قلب. حل Tyrode (الحل 2) 140 كلوريد الصوديوم ، 4 كيلو كلوريد ، 1 ملغ كلوريد₂ ، 10 هيبس ، 1 كلوريد الكالسيوم₂ ، 5 جلوكوز والتي يمكن تخزينها لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية. يضاف CaCl₂ والجلوكوز في يوم التجربة ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3-7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم المشبع في درجة حرارة الغرفة (28-30 درجة مئوية) باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.

< p class = "jove_content" > الجدول 2. حلول لعزل وتخزين CM للفأر البالغ.

حل المحتويات لاحظ محلول الهضم (الحل 3) محلول 25 مل 1 ، 6 ميكرولتر 100 ملم / لتر كلوريد الكالسيوم₂ ، 25 مجم كولاجيناز II ، 50 ميكرولتر (2.5٪ 10×) تريبسين لكل قلب حل الإيقاف 1 (الحل 4) محلول 9 مل 1 ، 1 مل FBS (مصل الأبقار الجنينية) ، 4 ميكرولتر 100 ملم / لتر CaCl₂ لكل قلب حل الإيقاف 2 (الحل 5) محلول 9.5 مل 1 ، 0.5 مل FBS (مصل الأبقار الجنينية) ، 4 ميكرولتر 100 ملي / لتر CaCl₂ لكل قلب محلول إعادة تعليق الخلية (الحل 6) محلول 13 مل 1 ، 7 ميكرولتر 1 م / لتر CaCl₂ ، BSA (ألبومين مصل الثور) بجرعة يمكن أن تشكل طبقة رقيقة تغطي سطح السائل لكل قلب

النتائج

الشكل 1. رسم تخطيطي لنظام Langendorff المعدل المجمع.هذا النظام اقتصادي ومحمول للمستخدمين. يحتوي على جزأين من الأنابيب البلاستيكية - أحدهما للماء (القطر الداخلي ، 8 مم) والآخر للتعقيد (القطر الداخلي ، 1.5 مم) - يتم توصيل الطرف البعيد منه بمحبس طبي ثلاثي الاتجاهات PE مع قفل Luer. زجاجة زجاجية تحتوي على ماء وذات سدادة مطاطية كمبادل حراري. يتم ضخ الريشة في الأنبوب البلاستيكي في المبادل ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2،3-بوتانديون مونوكسيم (BDM) سيجما ألدريتش 31550 كلوريد_{الهواء 2} سيجما ألدريتش سي 4901 الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 7528 هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 كيه سي إل سيجما ألدريتش ص 9333 KH₂PO₄ سيجما ألدريتش ص 5655 خاس₃ سيجما ألدريتش 237205 مغنكلوريد₂ سيجما ألدريتش M8266 MgSO₄ سيجما ألدريتش M7506 نا₂HPO₄ سيجما ألدريتش S7907 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 NaHCO₃ سيجما ألدريتش الطراز S5761 مضخة تمعجية مضخة أطول BT100-2J التورين سيجما ألدريتش تي 0625 حمام مائي جولابو إد (ع2)