$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. التحضير قبل عزل خلايا الصمام من الفئران البالغة
- قم بتنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية الموضحة في الشكل 1 أ باستخدام 70٪ v / v الإيثانول ثم تعقيمها لمدة 30 دقيقة.
- أضف 500 ميكرولتر من البنسلين والستربتومايسين إلى 50 مل من 10 مم HEPES. قم بإعداد كمية 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). احتفظ بالحلول على الجليد.
- قم بإعداد محاليل كولاجيناز 1 مجم / مل و 4.5 مجم / مل ، واستخدم 5 مل من كل محلول في أنابيب سعة 15 مل لتنفيذ الإجراء بأكمله. لتحضير 5 مل من 1 ملغم/مل من الكولاجيناز، اخلطي 5 ملغ من الكولاجيناز مع 2.5 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM، مصل الأبقار الجنيني الخالي من FBS)) و2.5 مل من 10 مللي من HEPES المكمل بالمضادات الحيوية (1٪ بنسلين-ستربتومايسين من الخطوة 1.2). قم بتصفية المحاليل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة أي تلوث.
ملاحظه: احتفظ بالمحاليل على الجليد لحماية الإنزيمات.
- قم بتسخين محلول DMEM إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامه في جميع الخطوات الموضحة أدناه. تحضير وسط كامل عن طريق مكملات DMEM ب 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، 5 مل من 200 ملي مولار ل-جلوتامين ، 1 مل من كاشف التخلص من الميكوبلازما (انظر جدول المواد) ، و 10٪ FBS.
< p class = "jove_title" >
2. عزل خلايا الصمام
- للحصول على 106 خلايا للتجربة ، استخدم خمسة فئران عمرها 8 أسابيع (ثلاثة على الأقل). ضع الفأر في غرفة الحث مع قطعة صغيرة من المناديل الورقية مبللة ب 1 مل من الأيزوفلوران ، لكن لا تسمح بملامسة الأنسجة. للتأكد من أن مخدر تماما ؛ تحقق من رد فعل قرصة إصبع القدم ، ثم قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم. استخدم الأيزوفلوران لتخفيف أي ألم قبل خلع عنق الرحم لأن الإجراء الموضح أدناه نهائي.
- ضع الماوس على منصة تشريح ، وقم بتثبيت الكفوف بالقنيات لتثبيتها في مكانها. تنظيف الصدر والبطن بالإيثانول. افتح البطن والصدر بالمقص. باستخدام مقص جراحي صغير ، اقطع بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر لإخراج الفأر. قم بدمج القلب ب 10 مل من البرد 1x PBS لإزالة الدم من القلب.
- اقطع القلب واحتفظ ب 3 مم من الشريان الأورطي الصاعد كما هو موضح في الشكل 1 ب. تشريح الصمام الأبهري تحت مجهر مجسم. اقطع القلب أفقيا في منتصف البطينين (الشكل 1 ج). اقطع البطين الأيسر باتجاه الشريان الأورطي ، وقم بتشريح الصمام الأبهري بعناية (الشكل 1D-F). قم بتجميع الصمامات معا في طبق صغير لزراعة الأنسجة مقاس 35 مم.
- اغسل الصمامات المعزولة في طبق زراعة الخلايا مقاس 75 مم مع 5 مل من HEPES البارد (10 ملم) مكمل بالمضادات الحيوية (1٪ بنسلين - ستربتومايسين) لإزالة الدم (الشكل 2). تحضير أنبوبين سعة 15 مل من الكولاجيناز 1 مجم / مل و 4.5 مجم / مل كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.3.< / >
ملاحظه: بعد التشريح ، قم بمعالجة الصمامات المعزولة في غطاء أمان حيوي معقم لتقليل التلوث.
- احتضان الصمامات في النوع الكولاجينيزي الأول (1 مجم / مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر (الشكل 2). قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 150 × جم ، واغسل الحبيبات مرة واحدة ب 2 مل من HEPES (10 مل) ، ودوامة لمدة 30 ثانية بسرعة عالية. صب محتويات هذا الأنبوب في طبق استزراع 35 مم ، وانقل شظايا الأنسجة بعناية باستخدام ملاقط رقيقة إلى أنبوب جديد.
ملاحظه: في هذه المرحلة ، لا تزال VICs غير منفصلة عن الأنسجة ، وتحتوي الحبيبات على قطع من الأنسجة. لتجنب التلوث بالخلايا البطانية ، لا تستخدم أجهزة الطرد المركزي بعد الدوامة في الخطوة 2.5.
- احتضان الحبيبات في أنبوب سعة 15 مل مع 5 مل من الكولاجيناز من النوع الأول (4.5 مجم / مل) عند 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر لمدة 35 دقيقة. أعد تعليق الخلايا بماصة 1 مل لفصل الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من DMEM الكامل. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين لتنظيف الخلايا.
ملاحظه: ستظل الحبيبات تحتوي على بعض شظايا الأنسجة.
- أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط الكامل ، وقم بوضع الخلايا في بئر واحد من طبق ثقافة الخلايا المكون من 6 آبار في الحد الأدنى من الوسط لتسهيل ارتباطها بطبق الثقافة. اترك الخلايا ، دون إزعاج ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- بعد 3 أيام ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر للتحقق من النمو الجيد بالقرب من بقايا الأنسجة. بمجرد ظهور 1,000 خلية تحت المجهر ، قم بإزالة بقايا الأنسجة بعناية باستخدام ملاقط معقمة ، وقم بتغيير الوسط.
ملاحظه: لا ينبغي إزعاج اللوحة. إذا لم يتم ملاحظة العدد المطلوب من الخلايا ، فضع طبق زراعة الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة يومين آخرين.
