$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE
فئة
1. تحضير محلول صبغة الميثيلين الأزرق
- قم بقياس 0.1 جم من مسحوق الميثيلين الأزرق.
- قم بإذابة الميثيلين الأزرق في محلول ملحي عادي 10 مل أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) تماما عن طريق الدوامة.
- قم بتصفية محلول الميثيلين الأزرق 10 مجم / مل باستخدام مرشح حقنة (حجم مسام الغشاء 0.45 ميكرومتر) للتخلص من الانسداد أثناء الحقن.
- قم بتجميع مجموعة أوردة فروة الرأس المعقمة (27 جم × 3/4 بوصة) بحقنة يمكن التخلص منها سعة 3 مل واملأ المحقنة بمحلول أزرق ميثيلين مفلتر سعة 3 مل.
ملاحظه: لمنع الضغط الهيدروستاتيكي وتدفق الصبغة اللاحق ، ضع طرف الإبرة فوق المحقنة المملوءة بمحلول الميثيلين الأزرق.
< p class = "jove_title" >
2. تشريح أجنة ما قبل الولادة
- نظف المقص والملقط التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- لجمع الأجنة في الفترة المحيطة بالولادة عند E18.5 أو E19.5 ، قم بالقتل الرحيم للفئران الحامل أولا باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة.
ملاحظه: عادة ما تلد أنثى الفأر الحامل بدءا من E18.5 ، ومع ذلك ، يسهل التلاعب بالكلى الكبيرة. لذلك ، من الأسهل إجراء هذا التحليل على الكلى عند E19.5 بالقرب من الولادة. ومع ذلك ، يموت الجراء الذين يعانون من انسداد المسالك البولية الثنائي بعد الولادة. اعتمادا على خصائص الفئران التجريبية ، يجب تحديد يوم / وقت التجميع المناسب تجريبيا.
- رش 70٪ من الإيثانول على سطح البطن البطني ثم افتح تجويف البطن بطنيا باستخدام مقص تشريح وملقط.
- ارفع الرحم بالكامل وافصله عن الجسم عن طريق القطع بمقص تشريح عند أطراف قرون الرحم.
- اشطف الرحم بالكامل ب 1x PBS في طبق بتري.
- اقطع الرحم بشكل مقطعي باستخدام مقص تشريح وقم بإزالة المشيمة بملقط تشريح لفضح الأجنة في أكياس الصفار
.
- قم بإزالة كيس الصفار أولا ثم قم بإزالة الغشاء الأمنيوسي باستخدام ملقط تشريح لتحرير الأجنة في الفترة المحيطة بالولادة.
- قطع رأس الجنين بمقص تشريح. امسح الدم الزائد بضمادات شاش معقمة. قم بتثبيت الجنين مع سطحه البطني لأعلى على مجهر تشريح مزود بكاميرا رقمية للتصوير. اجمع ذيله للتنميط الجيني إذا لزم الأمر.
ملاحظه: إجراء الحقن جنين واحد في كل مرة.
- افتح بعناية تجويف البطن للجنين بالملقط عن طريق تمزيق الجلد. بعد ذلك ، قم بإزالة الأعضاء والأنسجة الزائدة بعناية مثل الكبد والمعدة والأمعاء بالملقط عن طريق قطعها أو سحبها لفضح الكلى والحالب والمثانة الموجودة ظهريا (الشكل 1 أ). امتصاص الدم الزائد من الجنين المقطوع باستخدام ضمادات شاش معقمة إذا لزم الأمر.
ملاحظه: يتداخل الدم الزائد مع تحديد الحوض الكلوي لحقن الصبغة.
فئة < p = "jove_title" >
3. حقن صبغة الميثيلين الزرقاء في الحوض الكلوي ومراقبة تدفق الصبغة
- قم بإزالة الفقاعات الموجودة في الإبرة والأنابيب عن طريق طرد محلول الميثيلين الأزرق من طرف الإبرة عن طريق الضغط الهيدروستاتيكي. ارفع المحقنة التي تحتوي على محلول الصبغة فوق مستوى طرف الإبرة لبدء التدفق ، ثم اخفض المحقنة لإيقاف التدفق.
- أدخل الإبرة في الحوض الكلوي بالقرب من الحالب القريب ، مع الحرص على عدم إزعاجها بمجرد وضعها. قم بإجراء حقن الصبغة في الكلى لتحديد انسداد المسالك البولية.
ملاحظه: قم بإجراء حقن الصبغة في أي كلية غير طبيعية ، أولا ، باتباع نفس الطريقة لتحديد انسداد المسالك البولية.
- ارفع المحقنة لأعلى حوالي 20 سم لتوفير ضغط هيدروستاتيكي واترك 15 ميكرولتر - 60 ميكرولتر من محلول الصبغة يتدفق. سيكون معدل التدفق حوالي 3 ميكرولتر / ثانية إذا تم رفع المحقنة إلى هذا الارتفاع فوق الجنين.
- راقب اللون الأزرق للصبغة بدءا من الحوض الكلوي أولا ، ثم في طول الحالب ، وأخيرا في تجويف المثانة.
ملاحظه: يستغرق الأمر حوالي 5 ثوان لرؤية لون صبغة ضعيف يظهر داخل تجويف المثانة إذا تم إدخال الحالب بشكل صحيح في المثانة. اسمح للصبغة بالتراكم في الموقع المسدود حوالي 15 ثانية إذا لم يظهر لون صبغة في تجويف المثانة.
- ضع المحقنة لأسفل لإيقاف تدفق الصبغة وإزالة الإبرة من الكلى.
- التقط صورا للكلى والحالب والمثانة التي تم تتبعها بمحلول الصبغة باستخدام الكاميرا وبرنامج التصوير المتصل بمجهر مجسم.
- قم بعمل سجل لاستسقاء الكلى في الكلى ، والحالب المائية ، والموضع النهائي لمحلول الصبغة في دفتر ملاحظات المختبر.
- قم بإجراء حقن الكلية المقابلة كما هو موضح في الخطوة 3.1 إلى 3.5 والسماح بتدفق الصبغة حوالي 20 ثانية في المجموع.
ملاحظه: سيتم ملء تجويف المثانة بمحلول صبغة ، يشار إليه باللون الأزرق القوي ، إذا تم إدخال الحالب بشكل صحيح في تجويف المثانة. بعد تقييم انسداد تقاطع المسالك البولية ، يمكن تثبيت الحالب والمثانة للقسم.
