$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1.
- احتفظ بالفئران البالغة التي تتراوح أعمارها بين 3 و 6 أسابيع في غرفة ذات درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها (بمراحل 12L: 12D ويتم إطعامها بشكل خاص).
- حقن الفئران داخل الصفاق ب 2.5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) لتحفيز نمو البصيلات عن طريق محاكاة تأثيرات الهرمون المنبه للجريب (FSH). عزل المبايض لجمع البويضات التركية بعد 48 ساعة. قتل أنثى الفأر التي تم حقنها مسبقا ب PMSG ، وفقا للإرشادات القياسية.
- قم بإزالة المبايض بسرعة من تجويف الجسم وضعها في طبق بتري الذي يحتوي على وسط M2 لعزل البويضات اللاحق (انظر القسم 3).
- قم بعمل شق على الجلد الذي يغطي جدار البطن متبوعا بشق في الصفاق باستخدام مقص تشريح معقم. افتح الشق لكشف البطن ، وحرك الشجاعة على جانب واحد باستخدام ملاقط معقمة وقم بتحديد موقع أنابيب الرحم ، وتشكيل شكل V بدءا من المثانة.
- راقب المبايض الموجودة أسفل الكلى. أمسك كل أنبوب بملاقط معقمة وقم بعمل شق صغير في قاع المبايض لتحريرهما. انقل كلا المبيضين في قاع طبق بتري الذي يحتوي على وسط متوازن مسبقا.
فئة < ص = "jove_title" >
2. تحضير الهرمونات
- قم بتخفيف PMSG (متوفر بتركيزات مخزون مختلفة) بمحلول ملحي معقم متساوي التوتر للحصول على تركيز عمل يبلغ 2.5 هرمون وحدة دولية لكل 0.1 مل لحجم الحقن المناسب. < br / >
ملاحظه: يجب أن تكون المحاليل الهرمونية في أنابيب 0.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى يوم الاستخدام. لا تحتفظ بالحصص المخففة لمدة تزيد عن ثلاثة أشهر عند -20 درجة مئوية. بمجرد إذابة الجليد ، إذا تم إجراء الحقن التسلسلي ، قم بتخزين حصص المحاليل الهرمونية عند +4 درجة مئوية واستخدمها في غضون 4 أيام.
3. عزل البويضات الباطرة
< p class = "jove_content" >لعزل البويضات المناسب:
- موازنة M2 وسط (M2) عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء في إجراء عزل البويضات. قم بإعداد طبقين من بتري (35 مم × 10 مم) ، أحدهما يحتوي على 1 مل من M2 لثقب المبيض والثاني بقطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطى بالزيت المعدني (~ 1.5 مل) لنقل البويضات بعد عزلها من المبيض (انظر الخطوات 3.4-3.6). احتفظ بطبقي بتري في الحاضنة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
- استخدم المجهر المجسم أثناء إجراءات عزل البويضات.
- قم بإعداد ماصات زجاجية رقيقة الفم لتجميع البويضات عن طريق شد ماصات باستور الزجاجية المحفوظة أفقيا (تمسك طرفي الماصة بكلتا يديك)، فوق لهب عمودي قادم من موقد بنسن (الشكل 1).
- بمجرد أن يبدأ الزجاج في الذوبان ، أخرج الماصة من اللهب ، وقم بحركة سحب سريعة للحصول على الماصة المطلوبة. قم بقص الزجاج الزائد بإحكام بالقرب من النقطة الضيقة للماصة بأظافر الأصابع لضبط طول وقطر الشعيرات الدموية الداخلية. تأكد من أن الشعيرات الدموية الرقيقة لها قطر داخلي ~ 100 ميكرومتر ، أكبر قليلا من قطر البويضة (~ 80 ميكرومتر).
- لفم الماصة، قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب الشفاط بالماصة المسحوبة باستخدام طرف مناسب وضع الطرف الآخر في الفم، وثبته بالأسنان.
- اجمع المبايض باستخدام ملاقط معقمة وقم بإيداعها في قاع صحن بتري لزراعة الخلايا (35 مم × 10 مم). قم بتغطيتها ب 1 مل من M2 موازنة مسبقا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (الشكل 2).
ثقب - بصيلات المبايض الباطلية برفق بإبرة حقنة أنسولين معقمة لإطلاق البويضات الأذينية في M2 (الشكل 3).
- قم بإخراج البويضات برفق من خلال ماصة باستور ضيقة لإزالة خلايا البصيلات وأي بقايا أنسجة أخرى محتملة (الشكل 4 أ) ثم قم بتثبيتها في قاع قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة بزيت معدني مناسب لزراعة الأجنة (معدة مسبقا ؛ الشكل 4 ب).
ملاحظه: من المهم إزالة جميع الخلايا الركامية المرتبطة بالمنطقة الشفافة للبويضات عن طريق سحب العينة المستمر من خلال عدة قطرات مختلفة من M2. قم بتنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لتجنب التغيرات في درجة الحموضة في الوسط.
