$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة < p = "jove_title" >
1. حقن الراتنج المزدوج
- اعداد
- تحضير محلول الراتنج. بالنسبة لحقن راتنج النظام المزدوج ، قم بإعداد كل من الراتنجات الصفراء والخضراء كما هو موضح في الخطوات 1.1.2-1.1.4.
- تحضير 1 مل من الراتنج المخفف لكل فأر.
- الراتنج الأصفر: يخفف مطاط السيليكون الأصفر (الإشعاع العالي) مع المخفف الشفاف في تخفيف 3: 1 لتحضير الراتنج الأصفر للحقن.
- الراتنج الأخضر: امزج مطاط السيليكون الأزرق (الإشعاع غير القابل للكشف) مع المخفف الشفاف في تخفيف 1: 1 لتحضير الراتنج الأزرق. لتوليد الراتنج الأخضر ، امزج الراتنج الأزرق المخفف مع الراتنج الأصفر المخفف بنسبة 1: 1. دوامة الراتنج الأخضر جيدا حتى يصبح اللون متجانسا.
ملاحظه: يحتوي الراتنج الأزرق على إشعاع منخفض جدا لا يمكن اكتشافه باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الصغير ، مما يستلزم التخفيف بالراتنج الأصفر لإنشاء راتنجات ذات إشعاع مختلف.
أنذر: قد يحتوي الراتنج على كرومات الرصاص ، وهو مادة مسرطنة. ينتج غازات سامة في النار. تعامل بحذر وتخلص من الراتنج كنفايات خطرة.
- قم بإعداد مجموعتي حقن (مجموعة الحقن # 1 ومجموعة الحقن # 2) مع الأنابيب كما هو موضح في الخطوات 1.1.6-1.1.11.
ملاحظه: بالنسبة للفئران البالغة (>P30 (يوم ما بعد الولادة 30) = P30 - 2 سنة) ، استخدم مجموعة الحقن # 1 (أنابيب PE10 بقطر خارجي 0.6 مم) لحقن القناة الصفراوية الشائعة ومجموعة الحقن # 2 (أنابيب PE50 بقطر خارجي 0.96 مم) لحقن الوريد البابي. بالنسبة للفئران الصغيرة بعد الولادة (حتى P30) ، قم بإعداد مجموعتين من الحقن # 1 ، واحدة للقناة الصفراوية والأخرى لحقن الوريد البابي (لا توجد مجموعة حقن # 2 لأن الوريد البابي ضيق جدا بحيث لا يستوعب أنابيب PE50).
- لتحضير مجموعة الحقن # 1 ، قم بقص 30 سم من أنبوب PE10 وقم بتمديد أحد طرفي الأنبوب يدويا عن طريق سحبه حتى يصبح رقيقا قدر الإمكان (الشكل 1A ، B ، قطره حوالي 0.15 مم ، أنبوب PE10 غير الممتد يبلغ قطره 0.6 مم).
- اقطع طرف أنبوب PE10 الممتد قطريا لإنشاء طرف مشطوف (الشكل 1 ب).
- قم بتوصيل الطرف غير الممتد لأنبوب PE10 بإبرة 30 جم (الشكل 1 أ ، مجموعة الحقن # 1).
- لتحضير مجموعة الحقن # 2 ، قم بقص 30 سم من أنبوب PE50 وقم بتمديد أحد طرفي الأنبوب يدويا عن طريق سحبه حتى يصبح رقيقا بدرجة كافية ليناسب الوريد البابي (الشكل 1 أ ، ب ، حوالي 0.7 مم ، أنبوب PE50 غير الممتد يبلغ قطره 0.96 مم).
- قم بقص طرف أنبوب PE50 الممتد قطريا لإنشاء طرف مشطوف (الشكل 1 ب).
- قم بتوصيل الطرف غير الممتد لأنبوب PE50 بإبرة 23 G (الشكل 1A ، مجموعة الحقن # 2).
ملاحظه: يمكن استخدام كل مجموعة حقن لحقنة واحدة فقط لأن الراتنج سوف يتصلب في المحقنة والأنبوب. اضبط حجم الطرف الممتد والمشطوف بناء على حجم القناة الصفراوية المشتركة والوريد البابي للفأر ، اعتمادا على عمره ونمطه الجيني ونمطه الظاهري. عندما لا تكون متأكدا من حجم الأنبوب وملاءمته ، أدخل الأنبوب في القناة أو الوعاء المناسب بعد الشق وقبل ملء الأنبوب بالراتنج. إذا كان الأنبوب عريضا جدا بحيث لا يتناسب مع القناة / الوعاء ، فقم بتمديده أكثر.
- تخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (أول 4٪ في غرفة الحث و ~ 2٪ باستخدام مخروط الأنف).
- ضع الماوس على مقعد جيد التهوية على وسادة تشريح بينما يتنفس الفأر الأيزوفلوران من خلال مخروط الأنف. تحقق من أن فاقد للوعي بطريقة موصى بها من قبل المعهد / IRB ، على سبيل المثال ، عن طريق الضغط على أحد الكفوف.
أنذر: قد يسبب الأيزوفلوران النعاس أو الدوخة عند الاستنشاق وقد يتسبب في تلف نظام القلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي المركزي من خلال التعرض لفترات طويلة أو متكررة. لا تستنشقه. تعامل مع المادة على مقعد جيد التهوية وفي مناطق جيدة التهوية.
ملاحظه: من الممكن استخدام طريقة تخدير أخرى ، طالما أنها متوافقة مع نضح القلب.
- بمجرد أن يفقد الوعي ، رش الجانب البطني بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التداخل من الفراء.
- باستخدام مقص الجلد ، قم بقص الجلد واللفافة وطبقة العضلات بدءا من خط الوسط لتجويف البطن واقطعها إلى التجويف الصدري لكشف الأعضاء الداخلية.
- أمسك عملية الخنجري بالملقط لرفع القص وقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري على كلا الجانبين لفضح القلب والرئتين.
- قم بإزالة القفص الصدري عن طريق قطع الضلوع على الجانبين الأيسر والأيمن من القفص الصدري بالمقص. احرص على عدم تلف الكبد لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب الراتنج.
- باستخدام ملقط مستقيم ، اسحب القلب نحو الكبد واقطع الأذين الأيمن.
- أدخل إبرة فراشة (23 جم) متصلة بمضخة نضح تمعجي في البطين الأيسر. قم بدمج الماوس عبر القلب باستخدام محلول الملح المتوازن Hanks (HBSS) والهيبارين (1 U / g من وزن جسم الفأر). النفخ لمدة 3 دقائق بمعدل نضح 5 مل / دقيقة
ملاحظه: إذا تم ترشيح الفأر بشكل صحيح ، فستصبح الأعضاء الداخلية شاحبة ، وخاصة الكبد. إذا تحولت الرئتان إلى اللون الأبيض بدلا من ذلك ، يتم إدخال الإبرة في البطين الأيمن ويجب إعادة وضعها. بعد التروية ، يتم إخراج الفأر ويمكن إزالته من مخروط الأنف والأيزوفلوران.
- قم بإيقاف تشغيل مضخة الأيزوفلوران.
فئة
2. حقن الراتنج - صب الراتنج بنظام القنوات الصفراوية
- حرك الفأر إلى مجهر التشريح ، والبطن لأعلى ، والذيل نحو المجرب ، والتوجه بعيدا عن المجري. تم تصوير المعالم التشريحية ذات الأهمية في الشكل 2 أ.
- حدد موقع الوريد الأجوف السفلي (الشكل 2 أ) عن طريق تحريك الأمعاء إلى الجانب. استخدم مقص زنبركي لعمل شق عرضي صغير في الوريد الأجوف السفلي للسماح بإطلاق ضغط الأوعية الدموية الكبدية (الشكل 2Bi).
- كشف القناة الصفراوية المشتركة والوريد البابي كما هو موضح في الخطوات 1.2.4 - 1.2.6.
- انقل الأمعاء والبنكرياس إلى الجانب الأيمن (من المجري) باستخدام قطعة قطن مبللة بالفوسفات (PBS).
- اقلب الجانب البطني من الكبد باتجاه القلب باستخدام قطعة قطن مبللة ب PBS لكشف السطح الحشوي ومنطقة الوقابة.
- حدد موقع القناة الصفراوية المشتركة التي تمتد من منطقة القلعة عبر البنكرياس وإلى الأمعاء عند العضلة العاصرة لأودي (الشكل 2Bii ، القناة الصفراوية المشتركة الموضحة بالخط الأصفر المنقط ، تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى العضلة العاصرة ل Oddi).
ملاحظه: تأكد من أن الكبد رطب طوال العملية عن طريق رشه ب PBS.
- قم بتنظيف الأنسجة المحيطة (المنطقة ~ 5 مم) من القناة الصفراوية المشتركة باستخدام ملقط مستقيم. ضع خيط خياطة الحرير (مقاس 4-0 ، 0.17 مم ، بطول 3-5 سم) تحت القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Bii) واربط عقدة علوية فضفاضة حول القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Biii).
ملاحظه: اختر منطقة للعقدة في منتصف الطريق بين منطقة النقير والعضلة العاصرة لأودي وعلى مسافة ما من الوريد البابي بحيث لا تتداخل مع حقن الوريد البابي بعد شد الخيط حول القناة الصفراوية المشتركة.
- أمسك المقص الزنبركي بشكل مسطح مقابل القناة الصفراوية المشتركة لعمل شق مائل في القناة الصفراوية المشتركة في المكان الذي تدخل فيه القناة الصفراوية المشتركة إلى البنكرياس والأمعاء بجوار العضلة العاصرة لأودي. (الشكل 2Biv) ، يحدد الخط الأصفر المنقط العضلة العاصرة لمنطقة Oddi ، التي تؤكدها رؤوس الأسهم السوداء).
ملاحظه: وهذه خطوة حاسمة. قم بعمل قطع مائل وليس عرضي ، وقم بعمل شق ؛ لا تقطع القناة الصفراوية. قطع القناة الصفراوية بأكملها يجعل إدخال الأنبوب أمرا صعبا للغاية.
- قبل الاستخدام مباشرة ، امزج 1 مل من الراتنج الأصفر مع 50 ميكرولتر من عامل المعالجة (عن طريق ملء وتفريغ المحقنة سعة 1 مل) واملأ حقنة Luer سعة 1 مل بخليط عامل معالجة الراتنج.
- قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالأنبوب (المجموعة # 1). اضغط على المكبس لملء الأنبوب بالكامل. تأكد من أن مزيج الراتنج / عامل المعالجة يتساقط من طرف الأنبوب.
ملاحظه: تجنب وقم بإزالة الفقاعات الموجودة في المحقنة والأنابيب للحصول على أفضل النتائج.
- باستخدام الملقط ، قم بتصويب المنطقة المحيطة بشق القناة الصفراوية المشتركة وأدخل الأنبوب في الفتحة الموجودة في القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Bv) ، مع أطول حافة للطرف المشطوف لأسفل باتجاه الجانب الظهري من القناة الصفراوية. يضمن هذا الاتجاه أن الراتنج يمكن أن يخرج من فتحة الأنبوب ، التي تواجه لأعلى ، في القناة (الشكل 2Bv).
- شد عقدة الخيط الحريري لتأمين الأنبوب داخل القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Bvi).
- حقن الراتنج في القناة الصفراوية المشتركة. راقب المرارة وفصوص الكبد الفردية.
- دلكي الكبد بقطعة قطن مبللة ب PBS للمساعدة في توزيع الراتنج بالتساوي. الفروع الطرفية للقنوات الصفراوية المملوءة بالراتنج (في الفئران البرية) مرئية بشكل خافت على سطح الكبد.
ملاحظه: الوقت المتوقع لملء الكبد هو 30-100 ثانية.
- توقف عن حقن الراتنج عند ظهور نقاط من الراتنج على سطح الكبد (الشكل 2Ci ، رؤوس الأسهم الزرقاء) أو عند استيفاء المقاومة.
ملاحظه: اعمل بأسرع ما يمكن لأن الراتنج يبدأ في التصلب بعد إضافة عامل معالجة الراتنج. وقت العمل من إضافة عامل المعالجة حوالي 15 دقيقة.
- قم بإزالة الأنبوب عن طريق سحبه من القناة الصفراوية المشتركة وشد عقدة الحرير بسرعة باستخدام ملقط لمنع تسرب الراتنج. اقطع الأطراف السائبة لخياطة الحرير ، حتى لا تتداخل مع حقن الوريد البابي.
- تخلص من الأنبوب المحتوي على الراتنج والراتنج المتبقي في النفايات الخطرة والإبرة في نفايات الأدوات الحادة.
