نظام التسريب الدوائي المستمر في نموذج الفأر: إجراء جراحي لزرع نظام ضخ مضخة التناضح الدقيق في دماغ الفأر لتوصيل الدواء بشكل مستمر

الملخص

المصدر: Ajoy، R.، Chou، S. Y. دراسة إشارة الأنسولين تحت المهاد لعدم تحمل الجلوكوز المحيطي مع نظام ضخ الدواء المستمر في دماغ الفأر. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح تجميع نظام ضخ الدماغ بمضخة تناضحية دقيقة متبوعا بزرعه الجراحي في جمجمة الفأر. يتيح هذا النظام التوصيل المستمر للأدوية المحتملة ويسهل دراسة آثارها على الدماغ وأنسجة المخ.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير أنظمة ضخ المضخة التناضحية

الدقيقة

ملاحظة: قم بإعداد المضخة ، ومحلول السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) ، والدواء (محلول بروتين Met-CCL5 / RANTES (10 نانوغرام / مل في aCSF)) في ظروف معقمة باستخدام مخازن مؤقتة تمت ترشيحها بمرشحات 0.2 ميكرومتر وإجراء جميع الإجراءات تحت غطاء المزرعة بالقفازات. تتم إجراءات الجراحة على النحو التالي:

1. تحضير المضخات التناضحية الدقيقة قبل يوم واحد من الجراحة: املأ مضخة التناضح الدقيق للدماغ بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) بحقنة سعة 1 مل وإبرة رأس حادة مع المجموعة. اغمر المضخة التناضحية الدقيقة في aCSF وضعها على شاكر ورجها برفق طوال الليل><. تنبيه: يجب ملء المضخة ب aCSF ، ويجب تجنب فقاعات الهواء داخل المضخة (الشكل 1 أ).
2. قبل بدء الجراحة ، قم بإعداد محلول البروتين المؤتلف Met-CCL5 / RANTES (10 نانوغرام / مل ، مخفف في aCSF) لاستخدامه في التجربة. قم بإزالة aCSF من المضخة واملأ المضخة بمحلول الدواء ببطء حتى يتسرب الزائد.
   ملاحظة: محلول 15 مل aCSF أو Met-CCL5 / RANTES يكفي ل 5-8 مضخات.
   تنبيه: كرر الإجراء للتأكد من أن المضخة مملوءة بالكامل بالدواء بدون فقاعات بداخلها.
3. اقطع أنابيب القسطرة بالطول المطلوب وقم بتوصيلها بإبرة تسريب الدماغ ذات النهاية الحادة في مجموعة تسريب الدماغ. املأ مجموعة التسريب والأنابيب بالدواء.
4. أخيرا ، قم بتجميع مجموعة ضخ الدماغ وإرفاقها بالمضخة التناضحية الدقيقة.
   تنبيه: يجب عدم تكوين فقاعات في الأنبوب أو المضخة (الشكل 1 أ).
5. اغمر مجموعة اندماج المضخة التناضحية بالكامل في aCSF في أنبوب معقم سعة 50 مل لمنع المضخة من الجفاف. مجموعة اندماج المضخة التناضحية والدماغ جاهزة الآن للاستخدام في الجراحة.
   ملاحظة: يمكن استخدام أنظمة المضخات التناضحية الدقيقة لضخ الأدوية على المدى الطويل. هذا يضمن وضعا آمنا ومريحا لتوصيل المخدرات إلى دماغ الفأر.

2. جراحة البطين داخل المخ - زرع المضخة التناضحية الدقيقة

CAUTION: قم بتعقيم البيئة الجراحية بنسبة 75٪ من الإيثانول وتأكد من أن الأشخاص المشاركين في الدراسة يرتدون قفازات معقمة ومعطف مختبر نظيف. يجب تعقيم الأدوات / الأدوات الجراحية وتجفيفها قبل الاستخدام ، ثم تعقيمها لاحقا باستخدام 75٪ من الإيثانول بين جراحات الفئران.

1. قم بوزن الفأر وتخديره باستخدام الحقن داخل الصفاق (IP) مع الكيتامين / الزيلازين (الكيتامين 50 مجم / كجم ، الزيلازين 10 مجم / كجم).
   تنبيه: لا ينصح بأوزان جسم الفئران التي تقل عن 24 جراما لجراحة زرع المضخة التناضحية.
2. قم بتركيب رأس الماوس وتثبيته على الجهاز التجسيمي (الشكل 1 ب).
3. استخدم زوجا من المقصات والكماشة الجراحية لفتح الجلد الخارجي الذي يغطي الجمجمة. استخدم اليود لتنظيف الجمجمة الطرفية.
4. افصل الطبقة الخارجية من الجلد عن الجلد تحت الجلد بمساعدة زوج من الكماشة ذات الرأس الحاد بالقرب من منطقة الرقبة لزرع مجموعة اندماج المضخة التناضحية والدماغ (الشكل 1 ج).
5. ضع علامة على نقطة التسريب بالإشارة إلى خريطة الدماغ (الشكل 1D) باستخدام الجهاز التجسيمي. في هذه التجربة ، يجب زرع الإبرة في منطقة البطين 3 (Bregma: 0.0 مم جانبي ، 1.3 مم خلفي ، 5.7 مم بطني).
6. احفر حفرة باستخدام مثقاب الأظافر حول المنطقة المميزة على الجمجمة (الشكل 1E).
   تحذير: احرص على عدم كسر السحايا والأوعية الدموية في الفئران ، وبالتالي تجنب تعطيل الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ.
7. ضع مجموعة اندماج الدماغ ذات المضخة التناضحية الدقيقة التي تحتوي على aCSF (كعنصر تحكم) أو دواء (محلول بروتين Met-CCL5 / RANTES) تحت الجلد خلف منطقة الرقبة وأدخل إبرة تسريب الدماغ في الفتحة المحفورة لضخ الدواء في دماغ الفأر (الشكل 1E). سوف تخترق الإبرة السحايا وتدخل البطين. ثبت الإبرة في مكانها على الجمجمة باستخدام جل مزيل للحساسية السطحية (الشكل 1F) وانتظر 1-2 دقيقة حتى يجف الغراء. بعد ذلك ، قم بقطع الجزء البارز أعلى الإبرة (الشكل 1G-H).
8. استخدم غراء لاصق للأنسجة لشفاء جرح العملية على الرأس. ضع 50 ميكرولتر من الغراء فوق الجرح ، واسحب جانبي الجلد معا ، واستمر لمدة 30 ثانية للسماح للجلد بالإغلاق (الشكل 1I).
   تنبيه: استخدم وسادة كحولية بنسبة 100٪ لتنظيف الجرح بعد الجراحة و 100 أولتر بنسلين مع الستربتومايسين لمنع العدوى. ملاحظة: سيشكل جلد الفأر نسيجا ندبيا ويلتئم في غضون أيام قليلة بعد إعطاء الغراء الجراحي. الميزة الرئيسية للغراء هي تجنب الغرز الجراحية التي قد تسبب تهيج الجلد أو التهابه.
9. ضع الماوس في قفص نظيف محفوظ على طبق دافئ (يسخن حتى 37 درجة مئوية) وانتظر حتى يتعافى الماوس من تأثير التخدير.
   تنبيه: من الأهمية بمكان الحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر لتعزيز فرصة البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة.
10. بعد فترة نقاهة مدتها أسبوع واحد ، ستكون الفئران جاهزة لمزيد من التجارب ، مثل اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم (OGTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تحضير المضخة التناضحية وإجراء عملية جراحية في الفأر. (أ) مجموعة ضخ الدماغ وتحضير المضخة المملوءة بمحلول الدواء. تشير الأسهم الحمراء إلى أنابيب القسطرة المملوءة بالسائل. (ب) قم بتثبيت رأس الماوس وتركيبه على الجهاز التجسيمي. (ج) فصل الطبقة الخارجية من الجلد عن الجلد تحت الجلد لزرع مجموعة ضخ الدماغ بالتناضح الدقيق؛ تشير خطوط لوحة القيادة إلى موقع غرس...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لاصق الأنسجة Vetbond 3 م #1049SB الغراء المستخدم لإغلاق موقع الآفة على رأس الفأر LOCTITE 454 لاصق فوري شركة دوريت #8670 الغراء المستخدم لإصلاح الإبرة على جمجمة الماوس مضخة Alzet Micro- Osmotic شركة دوريت #9922 0.11 ميكرولتر في الساعة ، 28 يوما نظام تسريب الدماغ شركة دوريت #8851 1-3 مم ، تستخدم لنقل الدواء إلى دماغ الفئران وحدة التحكم MIO NE116 (مثقاب الأظافر) نظام ميو #E235-015 لحفر ثقب في جمجمة الفأر صيغة aCSF 119 ملي كلوريد الصوديوم 26.2 ملي هيدروكلوريد الصوديوم 3 2.5 ملي كلوريد الصوديوم 1 ملي هيدروشمولي الصوديوم 2 1.3 ملي ملي كلوريد الصوديوم 2 10 ملي مولار جلوكوز قم بتعقيم الفلتر باستخدام جهاز تصفية 0.22 ميكرومتر ، وتخزينه في 4 درجات مئوية.