$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. التصوير داخل الحيوية
- قم بتشغيل المجهر داخل الحيوية بما في ذلك طاقة الليزر.
- قم بتشغيل وسادة التسخين واضبط تنظيم الحرارة المنزلية على 37 درجة مئوية
ملاحظه: بدلا من ذلك ، استخدم وسادة أو مصباح تسخين سلبي مع تحكم متكرر إذا لم يكن هناك تنظيم حراري منزلي.
- خذ فأرا بنافذة بنكرياس مزروعة مسبقا. إجراء التخدير العضلي بمزيج من التيلامين / زولازيبام (30 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم).< / >
ملاحظه: يوصى باستخدام التيليتامين / الزولازيبام بدلا من الكيتامين بسبب تأثيره الضار على ارتفاع السكر في الدم. يجب اختيار التخدير الأمثل لغرض التجارب.
- أدخل قسطرة وعائية للحقن.
- اضغط على الجانب القريب من الذيل بالسبابة والإصبع الثالث كبديل لتطبيق عاصبة. سخني الذيل بمصباح إذا لزم الأمر.
- عقم وريد الذيل برذاذ الإيثانول بنسبة 70٪.
- أدخل قسطرة 30 جم في وريد الذيل الجانبي. سيتم تصور قلس الدم في أنبوب PE10.
- ضع شريطا حريريا على القسطرة لتثبيتها.
- حقن ديكستران FITC / TMR أو مجسات الفلورسنت الأخرى (25 ميكروغرام من مضاد CD31 المقترن ب Alexa 647) ، حسب الاقتضاء ، وفقا لمزيج من مجسات الفلورسنت.
ملاحظه: بالنسبة لمجسات الأجسام المضادة المترافقة الفلورية ، قم بالحقن قبل ساعتين من جلسة التصوير.
- انقل الماوس من المنصة الجراحية إلى مرحلة التصوير.
- أدخل مسبارا للمستقيم للتحكم تلقائيا في درجة حرارة الجسم باستخدام نظام وسادة التدفئة المنزلية.
- أدخل نافذة تصوير البنكرياس في حامل النافذة الذي تم إعداده أثناء إعداد الفحص المجهري داخل الحيوية (الشكل 1). بالنسبة للمجهر المقلوب ، قد لا تكون هناك حاجة إلى حامل نافذة.
- إجراء التصوير داخل الحيوية.
- لتصوير البنكرياس ، ابدأ بعدسة موضوعية منخفضة التكبير (على سبيل المثال ، 4x) لمسح المنظر الكامل للبنكرياس في نافذة تصوير البنكرياس (مجال الرؤية الموصى به: 2500 × 2500 ميكرومتر).
- بعد تحديد منطقة الاهتمام ، قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية مكبرة أعلى (20x أو 40x) لإجراء التصوير على المستوى الخلوي (مجال الرؤية الموصى به: 500 × 500 ميكرومتر أو 250 × 250 ميكرومتر). في هذه التجربة ، كانت الدقة الجانبية والمحورية حوالي 0.5 ميكرومتر و 3 ميكرومتر على التوالي.
- قم بإجراء تصوير z-stack أو تصوير بفاصل زمني لمراقبة البنية ثلاثية الأبعاد أو ديناميكيات المستوى الخلوي ، مثل ترحيل الخلايا.
ملاحظه: لتصوير الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري للحيوانات المعدلة وراثيا (MIP-GFP) ، كان من الممكن تحمل 30 ثانية من التعرض المتقطع لليزر 488 نانومتر بقوة تصل إلى 0.43 ميجاوات دون تبييض ضوئي ملحوظ أو تلف الأنسجة. لتصوير البروتينات الفلورية المسماة ب Alexa 647 ، كانت طاقة الليزر 640 نانومتر التي تصل إلى 0.17 ميجاوات مقبولة دون تبييض ضوئي ملحوظ أو تلف الأنسجة. قد يؤدي التعرض لليزر الإثارة لفترات طويلة بقوة أعلى من هذا الإعداد إلى التبييض الضوئي أو تلف الأنسجة بسبب السمية الضوئية. اضبط الكسب والقوة المناسبين لتصوير منطقة الاهتمام بشكل مناسب. يجب أن يكون الإعداد التفصيلي للمعلمات في الفحص المجهري داخل الحيوية فرديا لكل فحص مجهري داخل الحيوية يتم إعداده في المعهد.
