نموذج التروية القبلية: تقنية Ex Vivo لتنفيض قلب الفأر المعزول

الملخص

المصدر: Omatsu-Kanbe ، M. et al. ، طريقة نضح مسبق لعزل خلايا عضلة القلب من الفئران.

يصف هذا الفيديو تقنية نضح ما قبل قلب فأر معزول يتم خلالها حقن الإنشاءات من خلال البطين الأيسر ، وفي النهاية ، يخفق عضلة القلب بأكملها. يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل خلايا عضلة القلب من نماذج الفئران وتوليد قلوب منزوعة الخلايا لمزيد من التطبيقات النهائية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. نضح ما قبل قلب الفأر

ملاحظة: يجب أن تكون ماصة النقل البلاستيكية المستخدمة لامتصاص القلب ناعمة وألا تكون مدببة بشكل حاد باتجاه الحافة. اختر مشبك الأوعية الدموية الصغير مع مسننة. وترد قائمة بالصكوك الموصى بها في جدول المواد.

1. استئصال قلب الفأر وتثبيت الشريان الأورطي
   ملاحظه: يجب القتل الرحيم للفئران البالغة (>8 أسابيع) بجرعة زائدة من البنتوباربيتال الصوديوم (>300 مجم / كجم ، الحقن داخل الصفاق [IP]) مع الهيبارين (8000 وحدة / كغ).
   1. استئصال قلب الفأر بسرعة عن طريق المص.
      1. افتح تجويف الصدر بسرعة لكشف القلب. قم بقص ماصة النقل البلاستيكية ، التي يكون طرفها بنفس حجم القلب المكشوف تقريبا أو أصغر قليلا منه (عادة في موقع على بعد حوالي 1 سم من علامة 0.5 مل باتجاه الحافة ، ولكن ذلك يعتمد على حجم القلب).
      2. امتصاص القلب في الماصة ، وارفع الماصة لتوفير مساحة كافية لإدخال المقص ، واستئصال القلب بمقص منحني من الجانب الظهري ، وتجنب إتلاف الأذينين.
      3. انقل القلب المستأصل على الفور إلى دورق زجاجي سعة 30 مل يحتوي على CIB-EGTA المبرد بالثلج لوقف الانقباض. يستغرق هذا الإجراء عادة <1 دقيقة.
   2. التنظيف حول الشريان الأورطي
      1. انقل القلب إلى طبق استزراع مقاس 35 مم مليء ب CIB-EGTA المبرد بالثلج وقم بإزالة الرئة والأنسجة المرئية الأخرى ، ثم انقل القلب الذي تم تنظيفه تقريبا إلى حامل القلب المليء ب CIB-EGTA المبرد وضعه مع القمة لأسفل.
      2. تحت المجهر المجسم ، قم بإزالة الدهون والأنسجة الضامة لتنظيفها حول الشريان الأورطي. إذا كان طول الشريان الأورطي المقطوع طويلا جدا بما في ذلك الشريان العضدي الرأسي أو الشريان السباتي المشترك الأيسر أو الشريان تحت الترقوة الأيسر ، فقم بقطع الشريان الأورطي أسفل الشريان العضدي الرأسي مباشرة لتقصيره من أجل الانتقال إلى الخطوة التالية. يستغرق هذا الإجراء عادة حوالي 4 دقائق
   3. تثبيت الشريان الأورطي ووضع القلب المثبت على صفيحة التروية
      1. أدخل إبرة الحقن وابدأ التروية لتصريف الدم
         1. تحت المجهر ، ضع القلب في حامل القلب. يجب أن يواجه المشغل السطح الأمامي للقلب ، ويلتقط نهاية الشريان الأورطي بالملاقط ، ويثبت الشريان الأورطي بالقرب من الأذينين بمشبك وعائي صغير مع الضغط برفق على الشريان الأورطي قليلا.
         2. ضع القلب المثبت على صفيحة التروية بحيث يكون الجانب الأمامي لأعلى ، ثم قم بتغطيته ببضع قطرات من CIB-EGTA لمنعه من الجفاف. يستغرق هذا الإجراء عادة <20 ثانية.
      2. نضح القلب
         ملاحظه: أولا ، قم بتقويم القلب ب CIB-EGTA لتصريف الدم ومنع التخثر.
         1. أدخل إبرة الحقن وابدأ التروية لتصريف الدم
            1. اضبط المحقنة سعة 20 مل مملوءة ب CIB-EGTA الدافئ مسبقا والمتصلة بأنبوب التمديد المرن وإبرة حقن ملحوظة على مضخة التسريب. ابدأ تشغيل المضخة بمعدل بطيء يبلغ 0.5 مل / دقيقة لملء الإبرة والأنبوب بعناية ب CIB-EGTA وتأكد من منع أي هواء من دخول الأنبوب.
            2. ضع إبرة الحقن على لوحة التروية مع الجانب الأقصر من الشكل القطري في المقدمة. حرك الإبرة باتجاه قمة القلب حتى تلمسها ، ثم أدخل الإبرة بعناية بالقرب من قمة البطين الأيسر في حجرة البطين دون التواء. لا تفصل الإبرة عن اللوحة أثناء إجراء الإدخال.
            3. راقب العلامة الحمراء لتقدير عمق إدخال الإبرة. عند اكتمال إدخال الإبرة ، يجب أن يبدأ تدفق الدم من الشريان التاجي في الإفرازات.
            4. ثبت إبرة الحقن على اللوحة بشريط لاصق ، وقم بزيادة سرعة المضخة إلى 1 مل / دقيقة. يستغرق هذا الإجراء عادة حوالي 30 ثانية. إذا تم ترشيح القلب بنجاح ، فيمكن رؤية تدفق CIB-EGTA في الشعيرات الدموية أسفل النخاب
            .

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب التمديد أعلى ، اليابان س 1-50 تواصل مع حقنة وإبرة حقن للتروية القبلية. حصيرة سخان ناتسومي سيساكوشو ، اليابان ك إن-475-3-40 معدات لتدفئة لوحة التروية. مضخة التسريب تيرومو ، اليابان تي إي -311 مضخة حقنة التسريب للتروية المبكرة. إبرة الحقن (مقياس 27) تيرومو ، اليابان NN-2719S إبرة للإدخال في البطين الأيسر. الأنسولين (من البنكرياس البقري) سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية ط5500 يذوب في 0.1 م حمض الهيدروكلوريك. حقنة بلاستيكية (20 مل) تيرومو ، اليابان إس إس-20 إي إس يستخدم لتسريب CIB-EGTA. المشبك الوعائي Karl Hammacher GmbH, ألمانيا الصحة والسلامة والبيئة 004-35 مشبك وعائي مستقيم صغير يستخدم لقط الشريان الأورطي. جميع الكواشف الأخرى ناكالاي تيسك ، اليابان