مجموعة مستودعات الدهون البيضاء والبنية من جرو الفأر: إجراء جراحي لحصاد الأنسجة الدهنية البيضاء والأنسجة الدهنية البنية من جرو الفأر

الملخص

المصدر: Galmozzi ، A. et al. عزل وتمايز الخلايا الأولية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة. خبرة (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح الإجراء الجراحي لعزل الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد والأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين من فأر حديث الولادة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. جمع وهضم المستودعات الدهنية (اليوم 1)

1. قم بإعداد أنبوبين سعة 1.5 مل لكل جرو: أحدهما للأنسجة الدهنية البنية (BAT) والآخر للأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). أضف 250 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) + 200 ميكرولتر من 2x عازلة عزل (123 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 1.3 ملي كلوريد_{كناستوري 2} ، 5 ملي مولار جلوكوز ، 100 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثانإيثان سولفونيك حمض (HEPES) ، بنسلين ستربتومايسين ، و 4٪ ألبومين مصل بقري خال من الأحماض الدهنية) لكل أنبوب. حافظ على المحاليل معقمة وعلى الثلج.
2. ضع الجراء في غرف صغيرة (على سبيل المثال ، بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار) ، وضعها على الجليد حتى تصبح منخفضة الحرارة. تأكد من عدم وجود اتصال مباشر بين الجراء والجليد. وخز مخلب بطرف لضمان فقدان الوعي والقتل الرحيم للجراء عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص حاد.
   ملاحظة: إذا كنت تعمل مع أنماط وراثية مختلفة ، فقم بإعداد أنبوب إضافي لجمع خزعة الذيل (قطع 3 مم) للتنميط الجيني. إذا تم إجراء التنميط الجيني على الفور ، فاحتفظ بالجراء الرحيم على الجليد حتى التشريح لجمع مستودعات الدهون.
3. احسب ووزن كمية الكولاجيناز اللازمة لهضم جميع المستودعات. أضف 50 ميكرولتر من 15 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع الأول في 2x عازل إلى كل أنبوب. لا تقم بتعليق الكولاجيناز في عازلة معزولة حتى يتم جمع جميع الأنسجة.
4. لجمع WAT تحت الجلد ، قم بقص الجلد حول بطن الجرو (تجنب تمزق الصفاق) ، واسحب الجلد برفق أسفل الساقين. دون أخذ الجلد ، اجمع بعناية مستودع الدهون ، والذي سيظهر على شكل نسيج شفاف (P1 أو أصغر) أو أبيض (P2 وأقدم) ، نسيج رقيق وممدود متصل من الداخل أو فوق عضلات الفخذ (الشكل 1 أ ، ب). اشطف مستودع الدهون في PBS وضعه في أحد الأنابيب التي تحتوي على 250 ميكرولتر من PBS + 200 ميكرولتر من 2x عازل العزل. حافظ على الجليد.
   ملاحظة: تعطي الفئران P0 و P1 أفضل عائد. في الجراء P0-1 ، يكون مستودع WAT تحت الجلد شفافا تقريبا. في الفئران P2 والأكبر ، يسهل التعرف على المستودع لأنه يتحول بالفعل إلى اللون الأبيض ، مما يشير إلى وجود خلايا شحمية بيضاء ناضجة تماما ومحملة بالدهون.
5. لجمع BAT بين الكتفين ، اسحب الجلد من شفرات الكتف فوق الرأس. ارفع BAT - النسيج الأحمر الغامق بين لوحي الكتف - وقم بعمل شقوق بعناية في كل مكان حولها لفصلها عن الجسم (الشكل 1 أ ، ب). تحقق من الاتساق واللون. شطف مع PBS ؛ ضعه في الأنبوب الآخر الذي يحتوي على 250 ميكرولتر من PBS + 200 ميكرولتر من 2x عازل العزل ؛ واستمر في وضع الثلج.
   ملاحظة: عند حصاد BAT من الفئران P2 وكبار السن ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية البيضاء المحيطة بعناية ب BAT. يتكون من صفيحة رقيقة وناعمة وبيضاء من الخلايا الشحمية تقع بين الجلد و BAT ، وهي أعمق بين لوحي الكتف.

النتائج

الشكل 1: جمع ومعالجة ضمادات الدهون. (أ) التمثيل التخطيطي لعزل الخلايا الشحمية البيضاء الأولية (العلوي) والبني (السفلي). (ب) مستودعات دهنية بيضاء تحت الجلد (علوية) وبنية (أسفل). في الفئران P0 ، يكون WAT تحت الجلد غير مرئي تقريبا ، ولكنه يصبح قابلا للتمييز في ~ اليوم 2 بعد الولادة. في المقابل ، فإن BAT له لون غامق مميز حتى عند P0. في الجراء الأكبر سنا ، تكون BAT محاطة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 أطباق جيدة كورنينج 353046 BSA خال من الأحماض الدهنية سيجما ألدريتش أ 8806 كلوريد_{الهواء 2} سيجما ألدريتش سي 4901 الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 7021 هيبس سيجما ألدريتش إتش 3375 كيه سي إل سيجما ألدريتش ص 9333 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 القلم / البكتيريا العقدية جيبكو 15140122 ملقط جراحي شركة روبوز للأدوات الجراحية RS-5158 مقص جراحي شركة روبوز للأدوات الجراحية RS-5880 DPBS، خال من الكالسيوم والمغنيسيوم جيبكو 14190144