عزل الألياف العضلية : تقنية للحصول على الألياف العضلية المفردة من عضلات الباسطة الفأر المحصودة Digitorum Longus (EDL)

الملخص

المصدر: Hüettner، SS et al. مقايسة ثقافة الألياف العضلية المفردة لتقييم وظائف الخلايا الجذعية العضلية البالغة Ex vivo. J. Vis. Exp. (2021)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو عزل الألياف العضلية المفردة من عضلة الفئران الباسطة Digitorum Longus (EDL). يمكن زراعة الألياف العضلية المعزولة لدراسة نشاط الخلايا الجذعية العضلية المرتبطة بالألياف العضلية

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. عزل العضلات EDL وهضم الكولاجيناز

1. رش جميع المعدات بنسبة 70٪ من الإيثانول لتجنب التلوث.
2. التضحية بالفأر وفقا للوائح الوطنية للتجارب على.
3. رش الأطراف الخلفية للفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم مقصا منحنيا دقيقا (حافة قطع 24 مم) وملقطا دقيقا (دومون 7 ، منحني أو مستقيم) لإزالة الجلد وفضح العضلات الأساسية. تجنب أي ملامسة للعضلات الأساسية مع الفراء (يزيد من خطر التلوث).
4. قم بإزالة اللفافة المحيطة بملقط منحني ناعم دون الإضرار بالعضلات الأساسية (الشكل 1 أ). أغلق الملقط لتجنب الانحناء.
5. استخدم ملقطا منحنيا لكشف الأوتار البعيدة لعضلة الظنبوب الأمامية والعضلة الكهربية الكهربية. لإزالة TA ، أمسك الوتر البعيد TA بالملقط واقطعه بمقص زنبركي Vannas ناعم (حافة قطع 5 مم ، قطر طرف 0.35 مم). أثناء إمساك TA في الوتر ، اسحبه نحو الركبة وقطع العضلة بالقرب من الركبة (الشكل 1 ب) ، تتعرض عضلة EDRL الآن.
   ملاحظه: تأكد من الإمساك بوتر TA فقط في هذه الخطوة ، وإلا فقد يتلف EDL الأساسي. عند قطع عضلة TA ، تأكد من إمكانية رؤية الأوتار الموجودة في الركبة بسهولة بعد ذلك.
6. ارفع وتر EDL البعيد بملقط منحني ناعم واقطعه بمقص زنبركي Vannas ناعم (الشكل 1C). كشف وتر EDL القريب عن طريق سحب EDL بعناية نحو الركبة. قطع الوتر القريب بمقص زنبركي فاناس. انقل عضلة EDL إلى 37 درجة مئوية 2.5 مل من محلول هضم الكولاجيناز المسخن مسبقا ، في أنبوب تفاعل 15 مل. يتم تحضير محلول الكولاجيناز وفقا لهذا الإجراء:
   1. تحضير محلول هضم الكولاجيناز عن طريق إذابة 0.2٪ (وزن / حجم) من الكولاجيناز من النوع 1 (من المطثية النسيجية) في DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم) ، الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. (الشكل 1 د).
      ملاحظه: قم بعمل شق صغير في النسيج الضام الخارجي للركبة لكشف وتر EDL القريب بالكامل. تأكد من الإمساك بالأوتار فقط وعدم شد EDL كثيرا.
7. كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.6 مع EDL الثاني. أضف كلتا عضلتي EDL إلى نفس أنبوب التفاعل سعة 15 مل المملوء بمحلول هضم الكولاجيناز سعة 2.5 مل.
8. احتضان عضلات كهرباء لبنان في أنبوب التفاعل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي دائري.
   ملاحظه: يعتمد وقت الحضانة على عدة عوامل ، مثل نشاط الكولاجيناز وعمر الفأر وكمية الأنسجة الليفية. وقت الحضانة النموذجي لعضلات EDL للفئران البالغة (2-6 أشهر من العمر) هو 1-1.5 ساعة وللفئران المسنة (18 شهرا من العمر) 1.5-2 ساعة.
9. لتجنب الهضم المفرط للعضلات ، افحص العضلات أثناء وقت الهضم. أوقف عملية الهضم عندما ترتخي العضلات وتظهر الألياف العضلية المفردة (الشكل 1 ه). انقل العضلات بعناية باستخدام الماصة ذات التجويف الكبير إلى البئر الأول من الصفيحة المكونة من 12 بئرا المسخنة مسبقا والتي تحتوي على وسط عزل الألياف الميوغرافية (الشكل 1G) ، والتي يتم تحضيرها على النحو التالي:
   1. مكمل DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم) مع 20٪ FBS (مصل بقري الجنين) ، قم بالترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. أضف وسيطا إلى ألواح العزل المطلية مسبقا (لوح 12 بئرا ، وسط عزل 2-4 مل لكل بئر) قبل 30 دقيقة تقريبا من العزل وتوازن في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تفكك الألياف العضلية

1. للخطوات التالية ، استخدم مجهر مجهر استريو ، مجهز بشكل تفضيلي بلوحة تسخين (37 درجة مئوية). استخدم الماصة ذات التجويف الكبير لشطف العضلات بوسط عزل دافئ حتى يتم تحرير ألياف عضلية مفردة. قم بفصل العضلات مع الماصة ذات التجويف الكبير حتى يطفو العدد المطلوب من الألياف العضلية بحرية في المحلول.
   ملاحظه: تجنب التجربة المفرطة لتقليل مخاطر تلف الألياف العضلية. ينصح بشدة باستخدام لوحة تسخين لتفكك myofiber لأن درجة الحرارة تنخفض أثناء عملية العزل ، مما يؤدي إلى موت myofiber.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تشريح EDL للماوس وعزل مفرد myofiber.(أ) تتم إزالة جلد الطرف الخلفي للفأر وسحب العضلة المحيطة باللفافة بعيدا لكشف العضلة TA (الظنبوب الأمامية). (ب) تتم إزالة عضلة TA لكشف عضلة EDL (الباسطة الإصغامية الطويلة) ، المميزة بالسهم الأبيض. (ج) يتم تشريح العضلة الكهربية الكهربية عن طريق قطع أوتارها. (

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكولاجيناز من النوع 1 سيغما سي 0130 DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم) جيبكو 41966029 وسط زراعة الخلية مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10270-106 مصل الأبقار الجنينية