$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة < ص = "jove_title" >1. إبر زجاجية معقمة
- قم بتشغيل مجتذب ماصة الإبرة.
- اضبط مقبض السخان حتى تظهر الشاشة 12.6.
- افتح الباب وقم بتغذية الأنبوب الشعري سعة 5 ميكرولتر يدويا من خلال المشبك العلوي وخيوط السخان حتى يمتد نصف الأنبوب أسفل الفتيل (الشكل 1 أ).
- تأكد من أن الأنبوب الشعري موجود في الأخدود "V" في المشبك العلوي. شد المشبك العلوي.
- مع فتح المشبك السفلي ، اضبط الشريحة الرأسية يدويا لأعلى حتى يصل المشبك السفلي إلى الحد الأعلى. تأكد من أن الأنبوب في الأخدود "V" في المشبك السفلي. شد المشبك السفلي.
- أغلق الباب وتأكد من أن ضوء "جاهز" مضاء. اضغط على زر البدء لبدء السخان وتسلسل السحب (الشكل 1 ب).
- تأكد من إيقاف تشغيل السخان تلقائيا بعد أن تسحب الحرارة والجاذبية الأنبوب الشعري بعيدا (الشكل 1C) ، وتتحرك الشريحة لأسفل.
- افتح الباب. أثناء الإمساك بالجزء العلوي من الأنبوب الشعري ، قم بفك المشبك العلوي. قم بإزالة الأنبوب الشعري العلوي واتركه جانبا.
- أمسك الأنبوب الشعري في الشريحة السفلية وفك المشبك السفلي. قم بإزالة الأنبوب الشعري السفلي وضعه جانبا.
- استخدم شطفاء قطب كهربائي دقيق مع لوحة طحن جلخ الألومينا 0.05 ميكرومتر لشطبة الأنبوب الشعري المسحوب لإنشاء إبر الحقن.
- ماصة كمية كافية من الماء على لوحة الطحن لتغطية السطح (الشكل 1 د).
- قم بتشغيل المشطوف بحيث يبدأ في الدوران عند 60 دورة في الدقيقة. ضع الأنبوب الشعري المسحوب في مشبك الماصة في الأخدود "V". شد المشبك واضبط زاوية مشبك الماصة على 30 درجة.
- اضبط طرف الحافة المدببة للأنبوب الشعري على بعد ثلثي تقريبا من مركز دوران لوحة الطحن.
- قم بخفض الأنبوب الشعري المثبت عن طريق ضبط مقبض التحكم الخشن في الجزء العلوي من المناور. استمر في خفض الأنبوب الشعري حتى يمتد طرف الأنبوب الشعري تحت سطح الماء ويلامس السطح الكاشطة للوحة الطحن.
- راقب تقدم الشطف باستخدام المجهر المتصل بالبيفلر. بعد 5 دقائق ، اضبط التحكم الدقيق لرفع الإبرة الزجاجية من لوحة الطحن.
- قم بإزالة الإبرة الزجاجية وضعها تحت تكبير 10x للتحقق من طرف الأنبوب الشعري (الشكل 1E ، F).
- لضمان عدم وجود انسداد، أدخل الإبرة الزجاجية في حامل الماصة على حقنة وادفع الهواء إلى أنبوب سعة 1 مل يحتوي على 99٪ من الإيثانول. إذا تشكلت فقاعات هواء عند طرف الإبرة ، فإن الإبرة لا تحتوي على انسداد ويمكن استخدامها للحقن المجهري. تضمن هذه العملية أيضا عقم الإبر الزجاجية.
- يمكن أن يستوعب أنبوب شعري واحد ما يصل إلى 5 ميكرولتر من السوائل. ضع علامة على الأنبوب الشعري في 10 أقسام لحساب المسافات على الإبرة لتحديد أحجام 0.5 ميكرولتر. ضع علامة على مقياس بهذه المسافة يحمل 0.5 ميكرولتر للتحضير المستقبلي. بالنسبة لإبرة 5 ميكرولتر ، فإن المسافات التي تفصل بينها 0.7 مم تعادل 0.5 ميكرولتر (الشكل 1G).
فئة
2. حقن الفأر داخل الجسم الزجاجي
- تنفيذ جميع الإجراءات الواردة في هذا القسم وفقا لشروط السلامة البيولوجية من المستوى 2.
- قم بإعداد موقع الإجراء عن طريق وضع الوسادات السفلية الطبية على طاولة العمليات.
- قم بتشغيل الحاقن الدقيق وافتح صمام الغاز الموجود على خزان الهواء المضغوط المتصل بالحاقن الدقيق. اضبط منظم الخزان حتى يصل توصيل الغاز إلى حوالي 60 رطل لكل بوصة مربعة.
- في الحاقن الدقيق، اضغط على الوضع حتى تظهر الشاشة التوازن. اضغط على التوازن وضع ماوس الكمبيوتر على طاولة التشغيل. قم بتوصيل حامل الماصة المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ بالأنبوب المتصل ب "التعبئة/الإخراج" للحاقن. هذا الأنبوب متصل دائما بالحاقن.
- أدخل الإبرة الشعرية في الطرف الآخر من حامل الماصة عن طريق شد موصل حامل الماصة بإحكام حول الإبرة.
- قم بتشغيل مجهر العيون وقم بتشغيل ضوءه بكثافة 50٪. اضبط المجهر فوق موقع الإجراء على طاولة العمليات واضبط المجهر على التركيز المطلوب.
- قبل بدء الإجراء ، تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف عن طريق اختبار منعكس سحب الدواسة. تأكد من اتباع بروتوكول التخدير المعتمد من IACUC.
- ضع الفأر المخدر على الوسادات الداخلية الطبية مع توجيه أنفه إلى اليمين ومتكئا على جانبه الأيسر.
- انظر إلى العين اليمنى للفأر من خلال مجهر العين وافتح الجفون عن طريق فتح ملقط الملقط ذو التأثير العكسي على جانبي العين لفضح موقع الحقن (الشكل 2 ج).
- املأ الإبرة الشعرية بالمحلول البكتيري Bacillus cereus (ATCC 14579) (تخفيف 200 CFU / μL) عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على لوحة الماوس المتصلة بالحاقن الدقيق (الشكل 2 د).
- قم بتأمين رأس باليد اليسرى وضع طرف الإبرة عند طرف العين. مع وضع الإبرة في وضع شطبة وبزاوية 45 درجة ، قم بثقب عين الفأر ، ولكن تأكد من إدخال الطرف الحاد للإبرة (~ 0.5 مم) فقط عند الحقن.
- بمجرد إدخال طرف الإبرة ، حرك اليد اليسرى من رأس الماوس إلى لوحة الماوس وانقر بزر الماوس الأيمن على لوحة الماوس لحقن 0.5 ميكرولتر من B. المخيخ المخيع المخيع المحضر في مرق تسريب القلب في الدماغ (BHI). لمنع التسرب ، اترك طرف الإبرة داخل عين الماوس لمدة 2-3 ثوان قبل إزالته (الشكل 2 ه).
- حرر الملقط وضع الماوس في قفص يجلس على وسادة تسخين. راقب هذه الفئران حتى تتعافى من التخدير (الشكل 2F).
- بمجرد تعافي الفئران من التخدير ، أعد القفص إلى الرف المناسب. إذا خضعت الفئران لتحليل وظائف الشبكية عن طريق تخطيط كهربية الشبكية ، فيجب إعادة الأقفاص إلى غرفة مظلمة للتكيف الداكن بشكل صحيح.
