$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >1. تحضير أنبوب الحصاد
- ضع حبات زجاجية معقمة 1 مم في أنابيب غطاء لولبي سعة 1.5 مل.
- تعقيم هذه الأنابيب في الأوتوكلاف على بيئة جافة. دع الأنابيب تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- أضف 10 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل.
- أضف 1 قرص من قرص كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني إلى الأنبوب. تخلط عن طريق الدوامة.
- ماصة 400 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على مثبط للبروتياز في كل أنبوب حصاد معقم. قم بتسمية الأنابيب وضعها على الثلج. (الشكل 1 أ).
< ص الفئة = "jove_title" >2. حصاد العيون
- تنفيذ جميع الإجراءات الواردة في هذا القسم وفقا لشروط السلامة البيولوجية من المستوى 2.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون2. استخدم طريقة ثانوية لتأكيد القتل الرحيم.
- أمسك رأس الماوس القتل الرحيم بإحكام وافتح ملقط الطرف الناعم على جانبي العين المصابة. ادفع لأسفل باتجاه الرأس لتحفيز العين. بمجرد أن تصبح الملقط خلف كرة العين ، اضغط على الملقط معا. اسحب الملقط بعيدا عن الرأس لفصل مقلة العين (الشكل 1 ب).
- ضع مقلة العين على الفور في أنبوب حصاد مسمى. ضع الأنابيب على الجليد لمدة لا تزيد عن 60 دقيقة (الشكل 1 ج).
فئة < p = "jove_title" >3. عدد البكتيريا داخل العين
- تنفيذ جميع الإجراءات الواردة في هذا القسم وفقا لشروط السلامة البيولوجية من المستوى 2.
- تأكد من أن جميع أنابيب الحصاد مغلقة بإحكام ومتوازنة أثناء وجودها في مجانس الأنسجة (الشكل 2 أ). قم بتشغيل خالط الأنسجة لمدة 1 دقيقة لتجانس العينات. انتظر لمدة 30 ثانية ، ثم قم بتشغيله لمدة دقيقة أخرى. ضع الأنابيب على الجليد (الشكل 2 ب ، ج).
- قم بتخفيف كل عينة بشكل متسلسل 10 أضعاف عن طريق نقل 20 ميكرولتر من التجانس بالتتابع إلى 180 ميكرولتر من 1x PBS المعقم. خفف حتى يتم الوصول إلى عامل 10-7 (الشكل 2 د).
- قم بتسمية كل صف من لوحة BHI الدافئة والمربعة بعوامل التخفيف المناسبة. انقل 10 ميكرولتر من كل تخفيف على التوالي إلى لوحة BHI العلوية التي تميل بزاوية 45 درجة تقريبا. دع العينة تعمل حتى تصل تقريبا إلى قاع اللوحة ، ثم ضع اللوحة بشكل مسطح (الشكل 2 ه).
- عندما يتم امتصاص العينة في أجار BHI ، انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. يجب أن تبدأ المستعمرات في أن تكون مرئية بعد 8 ساعات من وضعها في الحاضنة.
- قم بإزالة اللوحة من الحاضنة قبل أن يتداخل نمو مستعمرات B. cereus مع تحديد المستعمرات الفردية (الشكل 2F).
- للحصول على تمثيل دقيق للتركيز في العينة ، احسب الصف الذي يحتوي على ما بين 10-100 مستعمرة. على سبيل المثال ، سيكون للصف الذي يحتوي على جزء التخفيف 10-4 الذي يحتوي على 45 مستعمرة تركيز 4.5 × 105 CFU / mL.
- لحساب العدد الإجمالي للبكتيريا لكل عين ، اضرب التركيز في 0.4 ، وهو ما يمثل حجم المليلتر البالغ 1x PBS المستخدم لتجانس العين. على سبيل المثال ، فإن تركيز 4.5 × 105 CFU / مل سيترجم إلى 1.8 × 105 CFU B. cereus لكل عين.
