عزل خلايا IPE و RPE: تقنية للحصول على الخلايا الظهارية الصبغية العيني من عين الأرنب

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Bascuas، T.، et al. العزل والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصبغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نعرض إجراء للحصول على الخلايا الظهارية الصبغية العينية من نموذج الأرانب. تساعد الخلايا في تطوير استراتيجيات علاجية للأمراض التنكسية في الشبكية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_content" > تم القتل الرحيم للأرانب البيضاء النيوزيلندية عن طريق جرعة زائدة من Pentobarbital (150 مجم / كجم) مخففة في 0.9٪ كلوريد الصوديوم المحقون داخل الصفاق وتم استئصال العينين مباشرة بعد التضحية.

< p class = "jove_title" >1. قبل التحضير

1. تحضير وسط كامل (DMEM/Ham's F12 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS)، و80 واحد/مل بنسلين / 80 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، و2.5 ميكروغرام/مل أمفوتريسين ب). قم بتسخين الوسط ، 1x PBS ، و 0.25٪ تريبسين (إذا لزم الأمر) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. ضع ستارة معقمة في غطاء المحرك لإعداد مكان عمل معقم. أدخل جميع الأدوات والمواد المعقمة اللازمة داخل غطاء المحرك.
   ملاحظه: فقط استئصال العينين وتنظيف الأنسجة العضلية والجلد المتبقي هي الإجراءات التي يتم إجراؤها خارج غطاء المحرك ، ويجب تنفيذ باقي الخطوات داخل الغطاء.

< p class = "jove_title" >2. عزل خلايا PE للأرانب

1. استخدم مقصا منحنيا وملقط كوليبري لاستئصال العينين بعد القتل الرحيم للحيوان. نظف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين باستخدام المقص والملقط (غير معقم).
   ملاحظه: يعتمد حجم المقص والملقط المستخدم في استئصال العينين وتنظيفها على الأنواع (على سبيل المثال ، بالنسبة للفئران والفأر ، ستكون الأدوات أصغر من تلك المستخدمة في الخنازير والماشية) (انظر الشكل 1).
   1. اجمع العينين في أنبوب سعة 50 مل مملوء ب PBS غير معقم وانقل الأنبوب إلى غطاء التدفق الرقائقي. تطهير العينين عن طريق الغمر لمدة دقيقتين في محلول قائم على اليود ، ثم انقلهما إلى طبق بتري مليء ب PBS المعقم.
2. فتح المصباح
   1. ضع عين واحدة على ضغط شاش معقم وثبته بإحكام بالقرب من العصب البصري. افتح العين بالمشرط # 11 والمقص حوالي 2 مم تحت الطرف. قم بإزالة الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية) وضعها في طبق بتري. اترك البصلة مع الجسم الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.
3. عزل خلايا IPE
   1. قم بإزالة العدسة وباستخدام ملقط دقيق ، اسحب القزحية التي تحتوي على خلايا IPE برفق. ضع القزحية في طبق بتري ، واغسلها ب PBS معقم واتركها في PBS حتى يتم تحضير المزيد من القزحية. قم بإزالة الجسم الهدبي من القزحية عن طريق القطع بمشرط # 10.
   2. بعد تحضير 2 قزحية ، احتضن ب 1 مل من 0.25٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ خلال هذا الوقت ، يمكن عزل خلايا RPE (انظر الخطوة 2.4). قم بإزالة التربسين وأضف 1 مل من الوسط الكامل إلى القزحية وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار. أعد تعليق الخلايا بعناية عن طريق سحب العينات ونقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وخفف 1: 3 باستخدام التريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
   3. إذا لم يتم نقلها على الفور ، فقم بزرع 200,000 خلية / بئر في صفيحة من 24 بئرا (100,000 خلية / سم²) في 1 مل من الوسط الكامل (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع الطبق في حاضنة وزرعته عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظه: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.
4. عزل خلايا RPE
   1. قم بإزالة الخلط الزجاجي وشبكية العين من الجزء الخلفي باستخدام ملقط رفيع. تجنب إتلاف ظهارة صبغة الشبكية.
   2. ضع شاشا معقما في طبق 12 بئر وضع المصباح فوق الشاش.
   3. يغسل مع PBS. أضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين لكل عين واحتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة التربسين وأضف 150 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل كرة أرضية وكشط خلايا RPE بدقة باستخدام ماصة باستور منحنية مصقولة بالنار ؛ استخدم ملقطا دقيقا لتثبيت الأنسجة. اجمع معلق الخلية وضعه في أنبوب سعة 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. قم بتخفيف 1: 4 باستخدام التريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
   4. الطرد المركزي للخلايا 10 دقائق عند 120 × جم.
   5. إذا لم يتم نقلها على الفور ، فقم بزرع 200,000 خلية / بئر في صفيحة من 24 بئرا (100,000 خلية / سم²) في 1 مل من الوسط الكامل (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع الطبق في حاضنة وزرعته عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظه: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.

النتائج

جنس علاج التربسين خلايا N° IPE N° خلايا RPE صفيحة للبذر (100,000 خلية / سم²) أرنب نعم ~350,000 ~ 2,500,000 أطباق 24 بئر

الجدول 1: عدد خلايا PE الأولية المعزو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 بئر لوحات كورنينج 353043 أطباق 24 بئر كورنينج 353047 البيتادين موندي فارما ملقط بون الصغير مسطح ملقط كوليبري (معقم) DMEM / هام F12 سيجما ألدريتش د8062 الستارة (معقمة) Mölnlycke الرعاية الصحية 800530 FBS برونشويغ P40-37500 ملقط (حجم مختلف) (معقم) ضغط الشاش بروميديكاليك إيه جي هاتف: 25403 كلوريد الصوديوم (0.9٪) مختبر الدكتور Bichsel AG 1000090 غرفة نيوباور مارينفيلد سوبيريور 640010 ماصة باستور (تلميع النار) ويتيج 4100150 برنامج تلفزيوني 1X سيجما ألدريتش د8537 البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش P0781-100 بنتوباربيتال (ثيوبنتال إنريسا) أوسبيدالیا إيه جي 31408025 طبق بتري ثيرموفيشر العلمي 150288 سحارب رقم 10 سوان مورتون 501 ريال سشع رقم 11 سوان مورتون 503 ريال مقص بون منحني حاد حاد (معقم) طرف حاد حاد مستقيم مقص بون فائق النعومة (معقم) التربسين 0.25٪ ثيرموفيشر العلمي 25050014 مقص زنبركي فاناس منحني (معقم)