عزل خلايا IPE و RPE: تقنية للحصول على الخلايا الظهارية المصطبغة من عين الخنازير المعزولة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Bascuas T. et al. ، العزل والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصبغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية لعزل القزحية والخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من عيون الخنازير للحصول على ثقافاتها الأولية لدراسات في الجسم الحي وخارج الجسم الحي. يمكن تعديل هذه الخلايا الصبغية وراثيا لدراسة الأساليب التجديدية لعلاج اضطرابات العين.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. قبل التحضير

1. تحضير وسط كامل (DMEM/Ham's F12 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS)، و80 واحد/مل بنسلين / 80 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، و2.5 ميكروغرام/مل أمفوتريسين ب). قم بتسخين الوسط ، 1x PBS ، و 0.25٪ تريبسين (إذا لزم الأمر) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. ضع ستارة معقمة في غطاء المحرك لإعداد مكان عمل معقم. أدخل جميع الأدوات والمواد المعقمة اللازمة داخل غطاء المحرك.
   ملاحظة: فقط استئصال العينين وتنظيف الأنسجة العضلية والجلد المتبقي هي الإجراءات التي يتم إجراؤها خارج غطاء المحرك ، ويجب تنفيذ باقي الخطوات داخل الغطاء.
3. تم الحصول على عيون الخنازير من مسلخ محلي في غضون 6 ساعات من التضحية وتم نقلها إلى المختبر على الجليد

فئة

2. عزل خلايا PE الخنازير

1. استخدم مقصا منحنيا وملقط كوليبري لاستئصال العينين بعد القتل الرحيم للحيوان. نظف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين باستخدام المقص والملقط (غير معقم).
   ملاحظه: يعتمد حجم المقص والملقط المستخدم في استئصال العينين وتنظيفها على الأنواع (على سبيل المثال ، بالنسبة للفئران والفأر ، ستكون الأدوات أصغر من تلك المستخدمة في الخنازير والماشية) (انظر الشكل 1).
   1. اجمع العينين في أنبوب سعة 50 مل مملوء ب PBS غير معقم وانقل الأنبوب إلى غطاء التدفق الرقائقي. تطهير العينين عن طريق الغمر لمدة دقيقتين في محلول قائم على اليود ، ثم انقلهما إلى طبق بتري مليء ب PBS المعقم.
   2. بعد نقل العينين إلى طبق بتري معقم ، أمسك واحدة بإحكام بالقرب من العصب البصري باستخدام كوليبري أو ملقط مدبب. قم بعمل ثقب بالقرب من حد القزحية (بين pars plana و ora serrata) بإبرة 18 G. أدخل مقصا صغيرا في الحفرة واقطع حول القزحية. قم بإزالة الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية) وضعها في طبق بتري. اترك البصلة مع الجسم الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.

3. عزل خلايا IPE

1. قم بإزالة الجسم الهدبي من القزحية عن طريق القطع بمشرط # 10. بعد تحضير 2 قزحية ، أضف 1 مل من الوسط الكامل وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وخفف 1: 4 باستخدام تريبان بلو لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
2. إذا لم يتم نقلها على الفور ، فقم بزرع 200,000 خلية / بئر في صفيحة من 24 بئرا (100,000 خلية / سم²) في 1 مل من الوسط الكامل (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع الطبق في حاضنة وزرعته عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.

4. عزل خلايا RPE

1. قم بتنفيذ الخطوة 1.1.1. ضع المصباح في طبق بتري واغسله باستخدام PBS. املأ المصباح ب 1 مل وسط كامل.
2. باستخدام ماصة باستور منحنية مصقولة بالحريق، قم بإزالة خلايا RPE بعناية. تأكد من الكشط من الأسفل إلى الأعلى لتجنب الانزلاق لأسفل من مركب غشاء المشيمية Bruch. اجمع تعليق الخلية داخل المصباح باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 مل لإعادة التعليق. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وخفف 1: 8 باستخدام تريبان بلو لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
3. خلايا البذور كما هو موضح في الخطوة 3.2.

النتائج

جنس علاج التربسين خلايا N° IPE N° خلايا RPE صفيحة للبذر (100,000 خلية / سم²) خنزير لا ~ 1،000،000 ~ 3،000،000 أطباق 24 بئر < p class = "jove_content" &g...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 بئر لوحات كورنينج 353043 أطباق 24 بئر كورنينج 353047 البيتادين موندي فارما ملقط بون الصغير مسطح ملقط كوليبري (معقم) DMEM / هام F12 سيجما ألدريتش د8062 FBS برونشويغ P40-37500 ملقط (أحجام مختلفة) (معقم) كلوريد الصوديوم (0.9٪) مختبر الدكتور Bichsel AG 1000090 إبرة (18 جرام) تيرومو مكررا NN1838R غرفة نيوباور مارينفيلد سوبيريور 640010 ماصة باستور (تلميع النار) ويتيج 4100150 برنامج تلفزيوني 1X سيجما ألدريتش د8537 البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش P0781-100 طبق بتري ثيرموفيشر العلمي 150288 سحارب رقم 10 سوان مورتون 501 ريال سشع رقم 11 سوان مورتون 503 ريال مقص بون منحني حاد حاد (معقم) طرف حاد حاد مستقيم مقص بون فائق النعومة (معقم) مقياس الخلوي القائم على الصور Tali ثيرموفيشر العلمي تي 10796 التربسين 0.25٪ ثيرموفيشر العلمي 25050014 التربسين 5٪ / EDTA 2٪ سيجما ألدريتش تي 4174 مقص زنبركي فاناس منحني (معقم)