نموذج القرنية الخنازير خارج الجسم الحي لالتهاب القرنية الجرثومي: تقنية لإثبات العدوى البكتيرية في الخلايا الظهارية للقرنية

الملخص

المصدر: Okurowska ، K. ، et al. إنشاء نموذج قرنية لحم الخنزير خارج الجسم الحي لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية الجرثومي. J. Vis. إكسب (2020).

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لإعداد نموذج خارج الجسم الحي لالتهاب القرنية الجرثومي باستخدام زر الصلبة القرنية الذي تم تشريحه من عين الخنازير. تعبر البكتيريا الملقحة الشقوق الظهارية للقرنية لغزو السدى الأساسي وإنشاء عدوى داخل أنسجة القرنية تحاكي عدوى في الجسم الحي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

< p class = "jove_title" >1. تحضير اللقاح

1. صب 10 مل من مرق LB في قارورة مخروطية سعة 50 مل باستخدام سدادة رغوية.
2. انقل مستعمرة من P. aeruginosa سلالة PAO1 أو سلالة PA14 من صفيحة أجار جديدة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات حتى تصبح البكتيريا في منتصف مرحلة السجل.
3. انقل مزرعة البكتيريا إلى أنبوب سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في PBS.
4. كرر الخطوة 1.3 مرتين أخريين لغسل الخلايا. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS واضبط الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.6 تقريبا باستخدام PBS المعقم كفارغ.

< p class = "jove_title" >2. إصابة زر القرنية

1. قم بإزالة الوسائط من طبق بتري واشطف القرنيات مرتين باستخدام 1 مل من PBS المعقم.
2. اضغط على الملقط برفق أثناء إمساك القرنية بينهما. استخدم مشرط 10A لعمل أربع قطع - اثنتان عموديتان ، اثنتان أفقيتان - في القسم المركزي من زر الصلبة القرنية من خلال الطبقة الظهارية إلى السدى الأساسي.
3. ضع قالبا زجاجيا معقما في طبق من 6 آبار مع الجزء العريض لأعلى وضع القرنية في منتصف القالب الزجاجي ، بحيث يكون جانب الظهارة متجها لأسفل. قم بعمل القطع في وسط الجزء السفلي من القالب الزجاجي.
4. الخطوة الحرجة: صب 1 مل من 1٪ (وزن / حجم) أجار منخفض نقطة الانصهار المذاب في DMEM لملء القالب الزجاجي بالقرنية تماما.
5. اسمح للأجار بالثبات ثم اقلب القالب الزجاجي بحيث تكون ظهارة القرنية متجهة لأعلى.
6. الماصة 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مع OD_{600 نانومتر} = 0.6 (بالنسبة إلى P. aeruginosa هذا يعادل ما يقرب من 1 × 10⁷ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) في 15 ميكرولتر) مباشرة في منطقة مقطوعة ثم أضف 85 ميكرولتر من PBS إلى الأعلى للحفاظ على رطوبة ظهارة القرنية. قم بتخفيف المزرعة البكتيرية المتبقية واللوحة على أجار لحساب وحدات تشكيل المستعمرة للتلقيح.
7. أضف 1 مل من DMEM بدون مضادات حيوية إلى قاع كل بئر باستخدام القالب الزجاجي. احتضان الصفيحة المكونة من 6 آبار بأزرار الصلبة القرنية المصابة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة تصل إلى 24 ساعة.
8. قم بإعداد قرنية مكافحة غير مصابة جنبا إلى جنب مع كل تجربة. لإعداد المكافحة غير المصابة ، استبدل 15 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية في الخطوة 2.6 ب PBS المعقم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 50 مل أنبوب فالكون SLS 352070 الأمفوتريسين ب سيغما أ 2942 سيلستار 12 لوحة بئر غرينر بيو ون 665180 ديكستران سيغما 31425-100 ملغ-F ديستيل فيشر ساينتيك 12899357 DMEM + جلوتاماكس SLS د0819 حاضنة فرن مزدوجة SLS ÖVe1020 فرن تعقيم عامل نمو البشرة SLS E5036-200UG F12 لحم الخنزير سيغما ن4888 مصل ربلة الساق الجنينية Labtech الدولية CA-115/500 ملقط فيشر ساينتيك 15307805 هيراسيل فيوس 160i الترمو: العلمية 15373212 حاضنة زراعة الأنسجة الأنسولين ، المؤتلف البشري SLS 91077C-1G أجار LB سيغما L2897 موليترون المعلومات غير قابل للتطبيق حاضنة بكتيرية برنامج تلفزيوني SLS ص 4417 البنسلين - ستربتومايسين SLS P0781 طبق بتري فيشر ساينتيك 12664785 طبق بتري 35x10mm CytoOne ستارلاب CC7672-3340 بوفيدون اليود صيدلية ويلدريكس 2122828 آمن 2020 فيشر ساينتيك 1284804 خزانة سلامة علم الأحياء الدقيقة من الفئة الثانية شفرة المشرط رقم 15 فيشر ساينتيك [أو305] مشرط سوان مورتون فيشر ساينتيك 11849002