نموذج رئة الخنزير خارج الجسم الحي للأغشية الحيوية: تقنية لتطوير نموذج الرئة لدراسة الأغشية الحيوية البكتيرية على أنسجة القصبات الهوائية للخنازير

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Harrington، N.E. et al.، اختبار فعالية المضادات الحيوية في نموذج خارج الجسم الحي من الزائفة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية في رئة التليف الكيسي. J. Vis. Exp. (2021).

يصف هذا الفيديو بروتوكول تطوير نموذج رئة خنزير خارج الجسم الحي للأغشية الحيوية البكتيرية على أنسجة الشعب الهوائية المصابة. الأغشية الحيوية عبارة عن مجاميع بكتيرية مدمجة في مصفوفة ملتصقة بالسطح. يستخدم هذا النموذج لدراسة قابلية البكتيريا للمضادات الحيوية في مراحل مختلفة من تكوين الأغشية الحيوية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تشريح وعدوى أنسجة رئة الخنازير خارج الجسم الحي (EVPL)

1. اصنع SCFM للاستخدام مع أنسجة EVPL ، اتبع وصفة 1 لتر من SCFM المعدل الوارد في الجدول 1.
2. قبل التشريح ، قم بإعداد لوحة / أطباق أجار من السلالة / السلالات البكتيرية المطلوبة للعدوى باستخدام أي أجار قياسي في المختبر ل P. aeruginosa / S. aureus (على سبيل المثال ، مرق lysogeny + 1.2٪ أجار).
3. احسب عدد قطع أنسجة القصبات الهوائية المطلوبة للتجربة ، بما في ذلك قطع الأنسجة الضابطة غير المصابة. اضرب هذا الرقم في اثنين لتكرار التجربة في رئتين مكررتين لتأكيد تكرار النتائج.
4. اضرب العدد الإجمالي لقطع الأنسجة المطلوبة في 0.5 لتحديد حجم SCFM agarose (mL) اللازم لصنع ضمادات الاغاروز لعمل وسيط كاف ل 400 ميكرولتر / قطعة منديل بالإضافة إلى SCFM agar الاحتياطي لحساب أي أخطاء في سحب العينة أو تبخر أثناء التحضير.
5. أضف 0.12 جم من الاغاروز إلى كل 15 مل من SCFM المطلوب لعمل الحجم الإجمالي المطلوب من SCFM مع 0.8٪ وزن / حجم agarose.
6. سخني محلول الاغاروز SCFM حتى يذوب الاغاروز تماما. يوصى باستخدام ميكروويف محلي على طاقة منخفضة. يعتمد الوقت المطلوب على القوة الكهربائية للميكروويف. اترك الاغاروز يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية (دافئ الملمس ولكن مريح للإمساك به). لا تدعه يبرد أكثر من ذلك.
7. باستخدام ماصة ، أضف 400 ميكرولتر من SCFM agarose إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا لكل قطعة من الأنسجة المطلوبة.
8. تعقيم لوح / ثانية يحتوي على SCFM agarose / 24 بئرا تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق.
9. قم بإعداد ثلاث غسلات مكررة لكل رئة سليمة يتم تشريحها باستخدام 20 مل من وسط النسر المعقم (DMEM) بالإضافة إلى 20 مل من معهد روزويل بارك التذكاري المعقم (RPMI) 1640 مكمل ب 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
10. اصنع كمية من 40 مل SCFM كغسل نهائي لكل رئة سليمة يتم تشريحها. يمكن تخزين جميع الغسالات طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو استخدامها على الفور.
11. احصل على الرئتين من المصدر المحدد في أسرع وقت ممكن بعد الذبح ، مع التأكد من بقائها باردة عن طريق نقلها إلى المختبر في صندوق تبريد منزلي.
    ملاحظه: تظهر الرئتان القريبتان من يوم الذبح كدمات أقل من التخزين ، ولكن يمكن أيضا استخدام الأنسجة المحفوظة في التخزين البارد لمدة تصل إلى 4 أيام من الذبح. نظرا لأنه يجب نقل صندوق التبريد إلى محل الجزارة أو المسلخ ، فيجب تطهيره وفقا لإرشادات المختبر المحلي بعد كل استخدام وتخزينه خارج مختبر علم الأحياء الدقيقة عندما لا يكون قيد الاستخدام ، لتقليل مخاطر التلوث وخرق الاحتواء.
12. العمل على سطح معقم وتحت اللهب ، ضع الرئتين على لوح تقطيع بلاستيكي نظيف مغطى بورق الألمنيوم المعقم. تأكد من بقاء القصيبات سليمة. إذا كان هناك أي ضرر في المسلخ أو أثناء النقل ، فإن الرئتين غير مناسبة للاستخدام.
13. قم بتسخين سكين لوح الألوان تحت اللهب ولمس السكين لفترة وجيزة جدا في منطقة الرئة المحيطة بالقصيبات لتعقيم سطح الأنسجة.
14. اقطع الأنسجة السطحية المحيطة بالقصيبات الهوائية باستخدام شفرة حلاقة معقمة. قم بعمل شقوق موازية للقصيبات الهوائية لمنع أي ضرر.
15. بمجرد تعرض القصيبات ، قم بعمل شق مقطعي عبر القصيبات الهوائية في أعلى نقطة مرئية لتحرير القصيبات.
16. باستخدام ملقط معقم ، أمسك الطرف الحر للقصيبات برفق وقم بقطع أي أنسجة غير مرغوب فيها متبقية باستخدام شفرة حلاقة معقمة. قم بعمل شق مقطعي نهائي عبر القصيبات قبل ظهور أي تفرع لإزالة القصيبات من الرئتين.
17. ضع القصيبات في أول غسول DMEM / RPMI 1640. اترك القصيبات في الغسيل وكرر الخطوات من 1.12 إلى 1.15 لحصاد أقسام إضافية من القصيبات من نفس الرئة كما هو مطلوب للحصول على أقسام أنسجة كافية للتجربة المخطط لها.
18. ضع أي أقسام قصبية إضافية من نفس الرئة في الغسيل (الخطوة 1.17). اتركيه في الغسيل لمدة 2 دقيقة على الأقل.
19. قم بإزالة القصيبات من أول غسول DMEM / RPMI 1640 وضع العينات في طبق بتري معقم.
20. أمسك كل قصيبات برفق باستخدام ملقط معقم ، مع التأكد من عدم إتلاف الأنسجة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة المتبقية وقطع الأنسجة إلى شرائح بعرض ~ 5 مم باستخدام مقص تشريح معقم.
21. ضع جميع شرائط أنسجة القصبات الهوائية في غسول DMEM/RPMI 1640 الثاني. اتركيه في الغسيل لمدة 2 دقيقة على الأقل.
22. قم بإزالة شرائط المناديل من الغسيل الثاني باستخدام ملقط معقم ، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة. ضع المنديل في طبق بتري نظيف ومعقم.
23. قم بإزالة أي أنسجة رخوة متبقية متصلة بالقصيبات وقطع الشرائط إلى مربعات (~ 5 مم × 5 مم) باستخدام مقص تشريح معقم.
24. أضف غسول DMEM / RPMI 1640 الثالث في طبق بتري. اخلطي قطع المناديل برفق في الغسيل عن طريق تحريك الطبق.
25. صب الغسيل الثالث من طبق بتري دون إزالة قطع المناديل.
26. أضف غسول SCFM النهائي إلى طبق بتري المحتوي على المناديل ، مع التأكد من تغطية جميع قطع المناديل.
27. تعقيم قطع المناديل في SCFM تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق.
28. استخدم ملقطا معقما لنقل كل قطعة من أنسجة القصبات الهوائية المعقمة إلى آبار فردية من صفيحة / أطباق 24 بئرا تحتوي على ضمادات الاغاروز SCFM.
29. لإصابة كل قطعة من الأنسجة بالسلالة البكتيرية المرغوبة ، المس مستعمرة نمت على صفيحة أجار بطرف إبرة 29 جم متصلة بحقنة أنسولين معقمة سعة 0.5 مل. ثم المس المستعمرة على قطعة الأنسجة ، وخز سطح الأنسجة برفق.
    ملاحظه: يسمح استخدام حقنة الأنسولين المزودة بإبرة 29 جم بإمساك الإبرة بدقة وراحة مع الحفاظ على الأصابع على مسافة آمنة من كل من الإبرة وأنسجة الرئة. من الممكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام إبر 29 G غير متصلة بحقنة ، لكن هذا يتطلب مهارة أكبر ويزيد من خطر إصابة الإبرة. محاقن الأنسولين متاحة بسهولة.
30. بالنسبة للعناصر الضابطة غير المصابة ، قم بوخز سطح كل قطعة من قطع الأنسجة برفق بطرف إبرة 29 جم متصلة بحقنة أنسولين معقمة سعة 0.5 مل.
31. استخدم ماصة لإضافة 500 ميكرولتر من SCFM إلى كل بئر.
قم
32. بتعقيم غشاء مانع للتسرب قابل للتنفس لكل صفيحة ذات 24 بئرا تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق (جدول المواد).
33. قم بإزالة الغطاء / الغطاءات من اللوحة / الألواح المكونة من 24 بئرا واستبدلها بغشاء قابل للتنفس.
34. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لوقت الحضانة المطلوب (العدوى) دون اهتزاز. تأكد من عدم وجود نمو مرئي لمسببات الأمراض الملقحة على قطع التحكم غير المصابة (مكافحة التلوث).
    ملاحظه: إذا رغبت في ذلك ، يمكن إضافة الأمبيسلين إلى وسادات الاغاروز SCFM وتغطية SCFM في الخطوة 1.31 إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام / مل. سيؤدي ذلك إلى تثبيط نمو معظم البكتيريا الذاتية على الرئتين دون التأثير على نمو المتصورة الزنجارية أو المكورات العنقودية الذهبية ، ولكن نظرا لأن وجود الأمبيسلين قد يؤثر على القابلية للمضادات الحيوية الأخرى ، يترك للقارئ اتخاذ هذا الاختيار اعتمادا على السلالات والمضادات الحيوية التي يرغبون في اختبارها.

< p class = "jove_content" > الجدول 1

فئة < p = "jove_title" >1. تحضير وسائط البلغم التليفية الكيسية الاصطناعية (SCFM) للاستخدام مع نموذج رئة خنزير خارج الجسم الحي

بمجرد صنعه ، يجب تعقيم SCFM بالترشيح ، ويمكن بعد ذلك تخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

أ) الوصفة الرئيسية الخطوة 1 كيميائي مبلغ تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM كلوريد الصوديوم 3.03 جرام أضف الأملاح والماء إلى تنظيف الزجاجة ، وتستخدم فقط لتحضير SCFM 51.85 دولار كيه سي إل 1.114 جرام 14.94 dH2O 640 مل غير متاح الخطوة 2 كيميائي مولارية المخزون المصنوع في الماء ، معقم بالفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM Na2HPO4 0.125 م أضف 10 مل من كل مرق إلى الأملاح والماء المحضر في الخطوة 1 1.25 NaH2PO4 0.13 م 1.30 NH4Cl 0.228 م 2.28 KNO3 0.0348 م 0.35 دولار ك 2SO4 0.0271 م 0.27 المماسح 1 م 10.00 الخطوة 3 كيميائي تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM 19 محلول أحماض أمينية محضر وفقا للقسم ب) أضف 10 مل من كل مخزون إلى المحلول المحضر في الخطوتين 1 و 2. انظر القسم ب) الخطوة 4 كيميائي تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم كما هو مطلوب استخدمه لضبط درجة الحموضة في المحلول المحضر في الخطوات من 1 إلى 3 إلى 6.8. حجم قياسي من الحمض / القاعدة المضافة. غير متاح الخطوة 5 كيميائي تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM dH2O أضف إلى المحلول المحضر في الخطوات 1-4 ، إلى الحجم النهائي 960 مل غير متاح الخطوة 6 كيميائي مولارية المخزون المصنوع في الماء ، معقم بالفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM CaCl2 0.175 م أضف 10 مل من كل مخزون إلى المحلول المحضر في الخطوات 1-5 1.75 كلوريد المغنيسيوم 2 0.0606 م 0.61 الخطوة 7 كيميائي مولارية المخزون المصنوع في الماء ، معقم بالفلتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM حمض اللاكتيك 0.93 م اصنع المرق في الماء ، درجة الحموضة إلى 7 مع 5M هيدروكسيد الصوديوم. أضف 10 مل إلى المحلول المحضر في الخطوات 1-6. 9.30 الخطوة 8 كيميائي مولارية مخزون العمل المصنوع في الماء ، مباشرة قبل إضافته إلى الوصفة تعليمات المليون النهائي في 1 لتر SCFM الحديد (III) SO4.7H2O 0.00036 مليون اصنع مخزونا رئيسيا بحجم 0.036 M ، والذي يمكن تعقيمه بالترشيح وتخزينه عند 4 درجات مئوية طالما ظل المحلول خاليا من الرواسب. لعمل مخزون العمل ، أضف 110 ميكرولتر من المخزون الرئيسي إلى 9.890 مل dH2O وأضف مخزون العمل إلى المحلول المحضر في الخطوات 1-7. 0.0036 ب) تحضير مخزون الأحماض الأمينية ؛ قم بتعقيمه قبل الاستخدام وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. الأحماض الأمينية مخزون mM تعليمات المليون النهائي في 1 لتر من الفرنك القياسي ألانين 178 تذوب في الماء 1.780 دولار أرجينين 30.6 تذوب في الماء 0.306 أسبارتات 82.7 [إ] تذوب في 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم 0.827 السيستين 16 تذوب في الماء 0.160 دولار حمض الجلوتاميك 154.9 دولار يذوب في 1 م حمض الهيدروكلوريك 1.549 جلايسين 120.3 دولار تذوب في الماء 1.203 [ا] هيستيدين 51.9 تذوب في الماء 0.519 إيزولوسين 112.1 يذوب في الماء عن طريق التسخين إلى 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على شاكر 1.121 دولار لوسين 160.9 [إ] تذوب في الماء 1.609 دولار أمريكي ليسين 212.8 دولار تذوب في الماء 2.128 دولار أمريكي الميثيونين 63.3 [إ] تذوب في الماء 0.633 أورنيثين حمض الهيدروكلوريك 67.6 تذوب في الماء 0.676 فينيل ألانين 53 تذوب في الماء 0.530 برولين 166 تذوب في الماء 1.660 دولار سيرين 144.6 [إ] تذوب في الماء 1.446 دولار ثريونين 107.2 تذوب في الماء 1.072 دولار تريبتوفان 1.3 يذوب في 0.2 م هيدروكسيد الصوديوم 0.013 التيروزين 80.2 تذوب في 1M هيدروكسيد الصوديوم 0.802 دولار فالين 111.7 تذوب في الماء 1.117 [إ]

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محاقن الأنسولين - 0.5 مل مع إبرة 29 جرام متصلة. VWR BDAM324892 لوحات ثقافة 24 بئر 70٪ إيثانول أو ما شابه ذلك للتعقيم السطحي وإشعال معدات التشريح ألواح أجار لتحضير خطوط المتصورة الزنجارية / المكورات العنقودية الذهبية (أي وسط مناسب) أغاروز رقائق الألومنيوم - معقمة مسبقا عن طريق التعقيم - لتغطية لوح التقطيع الذي ستقوم بتشريح الرئتين عليه. غشاء مانع للتسرب سهل التنفس أو التنفس أسهل للألواح متعددة الآبار التكنولوجيا الحيوية المتنوعة BEM-1 أو SARM-2000 موقد بنسن لوح التقطيع - نوصي باستخدام لوح بلاستيكي للسماح بإزالة التلوث بسهولة بالكحول. Coolbox لنقل الرئتين إلى المختبر مقص تشريح بأحجام مختلفة وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) سكين البليت الكبير شفرات الحلاقة المثبتة أطباق بتري لوح تقطيع بلاستيكي ورقائق ألومنيوم لإنشاء سطح تشريح معقم وقابل للتنظيف معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسط SCFM المكونات كما هو مذكور في الجدول 1 اختيار الملقط (يوصى بأطراف حادة) حاويات مناسبة للتخلص من الأدوات الحادة الملوثة وأنسجة رئة الخنازير ، وفقا لمؤسستك
سياسات الصحة والسلامة.