تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. إعداد الأجزاء الأمامية في أطباق زراعة الأعضاء
- ضع جزءا أماميا واحدا (AS) في طبق بتري مع AS مقلوب (كوب لأعلى). باستخدام قطعة قطن ، بللها في الوسائط وامسحها برفق في وسط القرنية لإزالة أي صبغة. باستخدام ملقط لتثبيت العين ونفس المسحة ، امسح قطعة القطن حول الصلبة لإزالة الصبغة الزائدة.
- اقلب AS وضعه فوق الجزء السفلي من الطبق فوق المنطقة المرتفعة ، مع توسيط القرنية فوق المنطقة المرتفعة في الطبق. ضع حلقة التثبيت أعلى AS.
- ضع أربعة براغي في الفتحات المقابلة لتثبيت الحلقة في مكانها مع وجود AS أسفل الحلقة. شد البراغي يدويا برفق باستخدام L-key.
ملاحظه: ستحدث خطوة الشد يوميا طوال التجربة ، لذا فإن الهدف من الشد الأولي هنا هو ضمان عدم تسرب الوسائط مع تجنب كسر حلقة التثبيت.
- باستخدام طقم أطباق بتري معقمة ، ضع الجزء العلوي فوق الطبق واقلب الإعداد. نعلق حامل الطبق. قم بتوصيل الموصلات السائلة بحلقات O بالمنافذ الملولبة في الجزء السفلي من الطبق.
- بموصل سائل واحد ، قم بتوصيل محور إبرة مثني 18 جم 90 درجة ، وطول الأنبوب ، ومحور إبرة 18 جيجا ، وفلتر حقنة نايلون ، وصمام ثلاثي الاتجاهات ، ومحقنة 20 مل مملوءة بالوسائط.
- إلى الموصل السائل الثاني ، قم بتوصيل محور إبرة منحني 18 جم 90 درجة ، وطول الأنبوب ، ومحور إبرة 18 جم ، وصمام ثلاثي الاتجاهات ، وجزء برميل من حقنة معقمة سعة 10 مل (سيكون هذا بمثابة خزان لالتقاط السائل والفقاعات من ASOC).
- مع فتح الصمامات ثلاثية الاتجاهات بشكل مناسب على المحاقن ، ادفع الوسائط برفق عبر النظام باستخدام منفذ موصل السوائل المحدد في الخطوة 1.5 لتضخيم AS ، وملء الوسائط في الأنبوب ، وفي النهاية الخزان.
ملاحظه: إذا تسربت الوسائط إلى طبق ASOC ، فلن يتم تأمين AS بإحكام بما فيه الكفاية باستخدام حلقة التثبيت.
- قم بإزالة الفقاعات عن طريق دفع الوسائط برفق إلى الطبق وقلب الطبق لدفع الفقاعات إلى الخزان.
- ضع الطبق وقف في وضع مستقيم. ضع الجزء السفلي من طبق بتري أسفل أقدام الحامل ، مع الحرص على عدم تورط الأنبوب.
< p class = "jove_title" >2. بدء ثقافة الأعضاء في الجزء الأمامي
- ASOC جاهز الآن للحضانة. ضع طبق ASOC في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2). تأكد من أن ارتفاع طبق ASOC في الحاضنة فوق محولات الضغط معروف ومحسوب لحساب ضغط العين (IOP) بدقة.
- قم بتوجيه خطوط الأنابيب للخارج من خلال الجزء السفلي من باب حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى لا تتداخل مع فتح وإغلاق الباب. قم بتوصيل المحقنة سعة 20 مل بمضخة الحقنة المضبوطة عند 2.5 ميكرولتر / دقيقة.
- ضع خط الأنبوب مع الخزان في أداة محول الضغط. قم بتوصيل الصمام الجانبي ثلاثي الاتجاهات بإعداد محول الضغط أثناء تدفق PBS عبر الخط لتجنب دخول فقاعات الهواء إلى خطوط الأنابيب.
ملاحظه: قم بإفراغ PBS من الخزانات بعد إعداد النظام لتقليل احتمالية تلوث الخزان بالنمو الميكروبي طوال مدة زراعة الأعضاء.
- ابدأ جمع بيانات IOP عن طريق التأكد أولا من وجود بطاقة microSD لحفظ ملفات البيانات. بعد ذلك ، قم بتشغيل إعداد محول الضغط لبدء جمع البيانات.
فئة
3. الصيانة اليومية ل ASOC
- بعد أن يكون لدى ASOC 24 ساعة للتوازن ، قم بإزالة الأطباق من حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 وضعها في خزانة السلامة الحيوية (BSC) II.
ملاحظه: عند الحصول على بيانات الضغط ، تبدو هذه الفترات الزمنية مثل المسامير حيث تتم إزالة ASOCs من الحاضنة (تغيير الارتفاع) وتعديلها في الخزانة.
- تحقق من وجود تسريبات تحت كل طبق على لوحة بتري. إذا كان موجودا ، تحقق من وجود وصلات سائلة ضيقة أسفل الطبق وأعد إحكام ربطها إذا لزم الأمر. تحقق من وجود تسريبات في الجزء العلوي من الطبق باستخدام مفتاح L معقم لتشديد البراغي في حلقة التثبيت.
ملاحظه: سوف يضغط نسيج الصلبة AS ويقلل من سمكه بمقدار 24 ساعة ، وستحتاج حلقة التثبيت إلى تشديدها.
- استنشق الوسائط من الطبق جيدا.
ملاحظه: تقوم الشبكة التربيقية بتصفية السوائل من الوسائط التي يتم ضخها إلى ASOC. لذلك ، ستكون الوسائط موجودة في طبق ASOC على طول الحواف.
- كرر الخطوتين 1.7 و 1.8 لإزالة أي فقاعات هواء محاصرة.
- أعد تعبئة المحاقن على مضخات الحقن ، وتأكد من تشغيل مضخات الحقن ، وتأكيد محاذاة الصمامات للتروية في ASOC. أعد طبق ASOC إلى حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظه: على النحو الأمثل ، يجب تنفيذ هذه الخطوات يوميا. ومع ذلك ، فإن استخدام حجم بدء 20 مل من الوسائط ، وحجم بئر طبق ASOC ، ومعدل المضخة البالغ 2.5 ميكرولتر / دقيقة يجب أن يكون كافيا للسماح للنظام بالعمل لعدة أيام دون إزعاج.
