توليد شرائح البطين الخنازيرية: تقنية قائمة على الاهتزاز لتحضير شرائح رقيقة جدا من أنسجة قلب الخنازير

الملخص

المصدر: Ou، Q. et al. ، تقطيع وقلوب الخنازير إلى شرائح واستزراعها في ظل الظروف الفسيولوجية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو إجراء قائما على الاهتزاز لإنشاء أقسام رقيقة جدا قابلة للحياة من قلب الخنزير. يمكن زراعة شرائح الأنسجة المحضرة واستخدامها كأنظمة نموذجية للاختبار الدوائي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تقطيع أنسجة قلب الخنزير

1. قم بإعداد حمام المناديل على الاهتزاز ، وأضف الثلج إلى سترة تبريد حمام المناديل ، ثم أضف محلول Tyrode إلى حمام المناديل. قم بإعداد وعاء بلاستيكي سعة 1 لتر لجمع التخلص من الثلج المذاب من سترة تبريد حمام المناديل. للحصول على 1 لتر من محلول التقطيع Tyrode ، اخلطي 3 جم / لتر 2،3-بوتانديون مونوكسيم (BDM) ، 140 ملي كلوريد الصوديوم (8.18 جم) ، 6 ملي كلوريد كلوريد (0.447 جم) ، 10 ملي مولار د-جلوكوز (1.86 جم) ، 10 ملي هيبس (2.38 جم) ، 1 ملي مجم كلوريد₂ (1 مل من محلول 1 م) ، 1.8 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} (1.8 مل من محلول 1 م) ، ما يصل إلى 1 لتر من ddH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.40 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول باستخدام 1,000 مل ، 0.22 ميكرومتر ، نظام فلتر / تخزين فراغ وتخزينه في 4 درجات مئوية طوال الليل.
2. تحت خزانة السلامة الحيوية ، انقل قلب الخنزير إلى صينية تحتوي على 1 لتر من محلول الترقيم القلبي البارد الطازج. للحصول على 1 لتر من محلول التوصيل القلبي ، امزج 110 ملي كلوريد الصوديوم (6.43 جم) ، 1.2 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} (1.2 مل من محلول 1 م) ، 16 ملي كلوريد كلوريد (1.19 جم) ، 16 ملي ملي كلوريد_{المغنيد 2} (3.25 جم) ، 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم₃ (0.84 جم) ، 1 وحدة / مل هيبارين ، حتى 1 لتر من ddH₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.40 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول باستخدام 1,000 مل ، 0.22 ميكرومتر ، مرشح / تخزين فراغ وتخزينه في 4 درجات مئوية طوال الليل><. ملاحظه: أضف 1,000 وحدة / لتر من الهيبارين في محلول شلل القلب في يوم التقطيع.
3. قم بتشريح القلب لعزل البطين الأيسر باستخدام مشارط معقمة قابلة للسحب. ثم قم بقطع البطين الأيسر إلى كتل من 1-2 سم³ لكل منها باستخدام شفرات مستطيل شائكة. استخدم قطعة واحدة للتقطيع واحتفظ بالقطع المتبقية في أنبوب سعة 50 مل في محلول Tyrode البارد على الثلج لتقطيعه لاحقا ، إذا لزم الأمر.
   ملاحظه: قم بتدليك المنديل قبل التقطيع باليدين ، خاصة إذا كانت هذه هي الكتلة الثانية. يساعد التدليك على استعادة التكوين الصحيح للألياف العضلية ويمنع أي تصلب داخل كتلة القلب.
4. أضف 1-2 قطرة من غراء المناديل (جدول المواد) إلى حامل العينة المعدنية وألصق قطعة من كتلة أجار 4٪ بمساحة سطح تبلغ حوالي 1 سم².
5. أضف 1-2 قطرات من غراء المناديل على الأجار.
6. ألصق كتلة القلب على الأجار بحيث يكون جانب النخا القلبي متجها لأسفل على غراء الأنسجة وتأكد من أنها مسطحة قدر الإمكان. بعد ذلك ، انقل حامل المناديل مع كتلة القلب إلى موضعه في حمام تقطيع الاهتزاز.
7. قم بتوصيل أنبوب الأكسجين بحمام التقطيع والصينية المعدنية المملوءة بمحلول Tyrode لجمع الشرائح (حمام Tyrode المؤكسج). ثم أضف مصافي خلية 40 ميكرومتر في الدرج المعدني لجمع الشرائح بعد التقطيع.
8. ضبط موضع التقطيع
   1. باستخدام برنامج تشغيل الاهتزاز ولوحة القيادة، اضبط ارتفاع الشفرة/العينة. حدد زر الارتفاع واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لضبط الارتفاع. من الناحية المثالية ، اجعل الشفرة قريبة من الجزء العلوي من الأنسجة ولكن أسفل العضلات الحليمية وتأكد من وجود سائل يغطي الأنسجة والشفرة قبل التقطيع.
   2. اضبط مكان بدء تقطيع الأنسجة عن طريق تحديد زر المتقدم. اضغط على زر الشريحة وقم بزيادة السرعة باستخدام المقبض لتحريك الشفرة نحو حافة الأنسجة. ثم اضغط على شريحة مرة أخرى للتوقف ، واضغط على زر التقدم لإلغاء تنشيط العملية.
   3. اضبط معلمات القطع: السرعة المتقدمة = 0.03 مم / ثانية ، وتردد الاهتزاز = 80 هرتز ، وسعة الاهتزاز الأفقية = 2 مم. ثم ابدأ في التقطيع عن طريق تحديد زر الشريحة.
   4. دع الاهتزاز يقطع حتى يصل إلى نهاية الأنسجة ولكن قبل أن يصطدم بالطرف الخلفي لحامل العينة. في هذه المرحلة ، اضغط على شريحة مرة أخرى للتوقف. اضغط على زر العودة للعودة إلى وضع البداية.
   5. حدد التكرار التلقائي (النقر فوقه مرتين) مما سيسمح للميكروتوم الاهتزازي بتكرار عملية التقطيع تلقائيا لمدة تصل إلى 99 مرة.
9. جمع الشرائح
   1. انتظر حتى تصبح الشرائح كاملة الطول وتظهر جيدة (بعد تجاوز طبقات العضلات الحليمية) ، ثم ابدأ في جمع الشرائح.
   2. اجمع الشرائح باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مملوءة بمحلول Tyrode البارد لامتصاص الأنسجة برفق من الحمام. إذا لزم الأمر ، استخدم الملقط والمقص الزنبركي لفصل الشريحة عن كتلة القلب إذا كان النسيج لا يزال متصلا.
   3. انقل الشريحة إلى مصفاة خلية واحدة في حمام Tyrode المؤكسج (انظر الخطوة 1.7) واستخدم السائل الموجود في ماصة باستور البلاستيكية لجعل الأنسجة مستوية على إحدى مصافي الخلايا ، ثم أضف غسالة معدنية في الأعلى لتثبيت المنديل لأسفل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغاروز Bioline الولايات المتحدة الأمريكية حيوية 41025 2،3-بوتانيديون مونوكسيم (BDM) صياد AC150375000 كلوريد الكالسيوم (CaCl₂) صياد سي 79-500 شفرات السيراميك لاهتزاز Microtome كامبدن انسترومنتس 7550-1-ج د-جلوكوز صياد د16-1 مشرط يمكن التخلص منه # 20 Biologyproducts.com DS20X مصافي خلايا الصقر ، معقمة ، كورنينج VWR 21008-952 ملح الصوديوم الهيبارين سيجما ألدريتش H3149-50KU هيبس صياد بي ت 310-1 غراء الأنسجة الزرقاء Histoacryl الامازون https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ مقص الربيع القزحية صياد NC9019530 مقص قزحية مستقيمة صياد 731210 كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) صياد م 33-500 منظم الأكسجين براكساير خزانات الأكسجين براكساير ماصات باستور بلاستيكية صياد 13-711-48 كلوريد البوتاسيوم (KCl) صياد AC193780010 شفرات مستطيل الحلاقة صياد 12-640 مشارط قابلة للسحب صياد 22-079-716 بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) صياد AC217125000 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) صياد AC327300010 الميكروتوم الاهتزازي كامبدن انسترومنتس 7000 SMZ-2