عزل مركب البويضات الركامية الخنازيرية: تقنية لعزل مركب البويضات الركامية من جريب مبيض الخنازير للتخصيب في المختبر

الملخص

المصدر: Gorczyca، G. et al.، الهلاميات المائية الألجينات المتدهورة البروتينية والمفاعلات الحيوية الدقيقة الكارهة للماء لتغليف بويضات الخنازير. J. Vis. إكسب. (2020).

يصف هذا الفيديو تقنية عزل مركب البويضات الركامية أو COC من مبيض الخنازير. يمكن استخدام COC السليم المعزول لإجراء الإخصاب في المختبر - تقنية المساعدة على الإنجاب لتطوير علاجات الخصوبة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل مجمعات الخنازير الركامية والبويضات

1. لجمع المواد لعزل بصيلات المبيض ، استئصال مبيض الخنازير من مذهب ما قبل البلوغ (حوالي 6-7 أشهر من العمر ، ويزن 70 إلى 80 كجم) في مسلخ محلي. اختر ما يقرب من 20 مبيضا للخنازير من 10 لعزل مجمعات البويضات الركامية (COCs) في كل تجربة.
   ملاحظه: بافتراض أن كل مبيض ينتج 3-5 بصيلات ، فإن العدد الإجمالي للبصيلات يتراوح من 60 إلى 100.
2. ضع المبايض في ترمس مع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4 ؛ 38 درجة مئوية) يحتوي على محلول مضاد للفطريات بنسبة 1٪ (AAS). تأكد من نقل المادة التجريبية إلى المختبر في غضون ساعة واحدة حيث يتم شطفها مرتين باستخدام PBS معقم يحتوي على مضادات حيوية.
3. بعد شطف المبايض ، انقلها إلى الدورق المملوء بوسط المناولة (HM) (جدول المواد) وقم بتخزينها في حاضنة عند 38 درجة مئوية لوقت جميع عمليات التلاعب.
   ملاحظه: للحصول على أفضل النتائج أثناء التعامل مع البويضات ، قم بتنفيذ جميع الإجراءات في وسط DMEM / F12 (وسط المناولة ، HM) مع إضافة 2.5٪ مضاد حيوي / AAS و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والتحكم في الرقم الهيدروجيني عند مستوى ثاني أكسيد الكربون₂ في البيئة ، على طاولة تسخين مع التحكم في درجة الحرارة (38 درجة مئوية) وتحت غطاء التدفق الرقائقي لتقليل التلوث البكتيري.
4. من بصيلات الخنازير الكبيرة (قطرها 6-8 مم) ، اجمع السائل الجريبي (FF) عن طريق الشفط والطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية باستخدام حقنة معقمة متصلة بمرشحات مسام غشائية 0.2 ميكرومتر وقم بالتجميد عند -80 درجة مئوية < br / > ملاحظه: استخدم حقنة الأنسولين (u-40) لشفط السائل الجريبي.
5. تأكد من اختيار بصيلات صحية ومتوسطة الحجم فقط (قطرها 4-6 مم) لعزل COCs.
   ملاحظه: تعتبر COCs من الدرجة الأولى ، التي تمتلك بويضة سليمة ومستديرة مع أوبلازم متجانس ومتعددة الطبقات (على الأقل 3-4) ركامية مضغوطة مناسبة لمزيد من إجراء IVM ثلاثي الأبعاد.
6. لعزل COCs ، انقل 2-3 مبيضين إلى طبق بتري معقم بقطر 10 سم مملوء ب HM. اعزل COCs عن البصيلات متوسطة الحجم باتباع أحد الإجراءات أدناه.
   1. قم بقص سطح بصيلات المبيض البارزة برفق بشفرة جراحية معقمة 15 درجة مئوية. سيؤدي ذلك إلى تدفق السائل الجريبي جنبا إلى جنب مع COCs إلى طبق بتري.
   2. قم بشفط محتوى البصيلات باستخدام إبرة 28 جم بحجم 5/8 بوصة متصلة بحقنة يمكن التخلص منها ونقلها إلى طبق بتري.
      ملاحظه: تخلص من بقايا أنسجة المبيض. يتم تنفيذ المراحل اللاحقة من العزل تحت مجهر مجسم.
7. قم بإعداد 3-5 أطباق بتري بيني بحجم 60 مم من التلقيح الاصطناعي.
   1. أضف 1 مل من HM إلى الآبار المركزية وضع 3-4 قطرات من HM (50 ميكرولتر لكل قطرة) في حلقاتها الخارجية.
   2. بعد ذلك ، باستخدام ماصة دقيقة من البولي كربونات ، انقل COCs غير التالفة إلى قطرات HM في الحلقات الخارجية لشطفها لفترة وجيزة لمدة 3-4 مرات.
   3. في النهاية ، قم بنقلها بشكل فردي إلى البئر المركزي. قم بتخزين لوحات التلقيح الاصطناعي هذه في حاضنة لمزيد من الإجراءات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات عام مضاد حيوي مضاد فطريات (100x) 100 مل ثيرمو فيشر 15240062 2.5٪ تركيز نهائي لوسط المناولة. 1٪ في PBS (الخطوة 1.2) DMEM/F12 (500 مل) سيجما ألدريتش د8062 المناولة المتوسطة FCS (100 مل) ثيرمو فيشر 16140063 تركيز نهائي 10٪ لوسط المناولة. (الخطوة: 1.5) برنامج تلفزيوني (1x ، درجة الحموضة 7.4) 500 مل ثيرمو فيشر 10010023 وسط النضج قوات حرس السواحل الهايتية (1 قارورة من 10 000 وحدة واحدة) سيجما ألدريتش سي جي 10 PMSG البائع الحيوي RP1782721000 أدوات وأدوات محددة طبق بيتري 30 مم برنامج النقاط التجارية 93040 60 ملم التلقيح الاصطناعي بتري صحن صقر 353653 حاضنه باناسونيك MCO-170AIC-PE يمكن استخدام ماركات أخرى طبق بتري معقم (10 سم) NEST التكنولوجيا الحيوية 704002 الترمس الكيشوا 5602589 يمكن استخدام ماركات أخرى