$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. التغليف في المفاعلات الحيوية الدقيقة المصنوعة من الإيثيلين بروبيلين المفلور (FEP) الكارهة للموع.
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تأكد من تنفيذ جميع إجراءات النضج في المختبر (IVM) على طاولة يتم التحكم فيها حراريا ، ويتم الحفاظ على مجمعات البويضات الركامية (COCs) عند 38 درجة مئوية طوال فترة التعامل معها.
- قم بإعداد طبق بتري مقاس 30 مم يحتوي على 5 جم من مسحوق FEP متوسط حجم الجسيمات 1 ميكرومتر < br / >
ملاحظة: من المهم استخدام مسحوق FEP الطازج. يميل FEP المعاد استخدامه إلى التجميع وتشكيل الكتل.
- قم بتوزيع قطرة واحدة من وسط النضج (مم) (~ 30 ميكرولتر في الحجم) تحتوي على 3-5 COCs على طبقة مسحوق FEP. قم بتدوير اللوحة برفق في حركة دائرية للتأكد من أن هذه الجسيمات غطت سطح قطرة السائل والرخام السائل المتشكل بالكامل (LM).
- التقط LM المشكل باستخدام ماصة ذات طرف 1,000 ميكرولتر.
ملاحظة: قم بقص طرف الماصة عند الحافة لاستيعابها مع قطر LM (4-5 مم). يجب أن يكون القطر التقريبي لمثل هذا الطرف المحضر أكبر قليلا من القطر المحوري.
- قم بإعداد عدة أطباق بتري بيتري بحجم 60 مم في المختبر (IVF). أضف 3-4 مل من الماء المعقم إلى الحلقات الخارجية لتحضير غرفة الرطوبة. بعد ذلك ، ضع LM واحدا في البئر المركزي.
ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مهارات يدوية جيدة ودقة - إذا تم وضع الرخام بلا مبالاة أو سقط حتى من ارتفاع منخفض ، تدميره.
- احتضان الرخام لمدة 4 أيام عند 38 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪.
- قم بتغيير الوسيط يوميا بعد الإجراء: ضع 30 ميكرولتر من MM على كل LM ، مما سيؤدي إلى انتشارها لأن ملامسة السائل المباشر تعطل مقاومة الماء لمساحيق FEP المطلية. عندما يذوب محتوى الرخام ، انقل COCs المنبعثة من المفاعل الحيوي إلى قطرة من MM الطازج في طبق بتري.
ملاحظة: لنقل COCs التي تم إطلاقها بدقة، استخدم ماصة دقيقة من البولي كربونات.
- بعد عدة غسلات في مم (3-4 مرات) لإزالة جزيئات FEP ، انقلها مع 30 ميكرولتر من MM الطازج إلى طبقة مسحوق FEP. قم بتدوير اللوحة برفق بحركة دائرية للتأكد من أن جزيئات المسحوق تغطي سطح قطرة السائل بالكامل وتشكل LM جديدا.
- التقط LM المشكل باستخدام ماصة ذات طرف 1,000 ميكرولتر.
- أضف 3-4 مل من الماء المعقم إلى الحلقات الخارجية لتحضير غرفة الرطوبة. بعد ذلك ، ضع LM واحدا في البئر المركزي لطبق بتري أطفال الأنابيب.
ملاحظة: يسمح الطلاء الشفاف لمسحوق FEP بمراقبة محتوى LM باستخدام مجهر ضوئي.