الاستئصال الانتقائي بمساعدة الليزر للخلايا البطانية القرنية الخنزيرية: تقنية للحث على إصابة بطانة قرنية الخنازير المركزة لدراسات خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Holzhey، A. et al.، تطوير نموذج تجريبي غير جراحي بمساعدة الليزر لفقدان الخلايا البطانية القرنية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو إجراء غير جراحي بمساعدة الليزر لإتلاف الخلايا البطانية القرنية في عين الخنازير بشكل انتقائي يمكن استخدام نموذج ex vivo المطور لتلف الخلايا البطانية لدراسة أمراض بطانة القرنية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحضير زراعة الأعضاء والعلاج بالليزر

1. احصل على عيون الخنازير الطازجة من المسلخ المحلي. حافظ على برودة (4 درجات مئوية) في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز ، مع استكمال L-glutamine ، وبيروفات الصوديوم ، والبنسلين / الستربتومايسين (1٪) ، ومصل الخنازير (10٪) ، المشار إليه من الآن فصاعدا في هذه المقالة على أنه وسيط كامل.
2. قم بإزالة الأنسجة خارج الخلية بالمقص وانقع العينين في محلول عيون بوفيدون اليود بنسبة 5٪ لمدة 5 دقائق قبل وضعها في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) حتى الاستخدام.
3. فحص العيون لأمراض الجزء الأمامي الرئيسية ، مثل تندب القرنية والوذمة والعتامة الأخرى باستخدام جهاز التصوير المقطعي للتماسك البصري في المجال الطيفي (جدول المواد).
4. ضع العينين أمام وحدة المصباح الشقي المجهزة بليزر Nd: YAG (جدول المواد) ، الذي يبلغ طوله الموجي 1,064 نانومتر وقطر بقعة بؤرية يبلغ 10 ميكرومتر في الهواء.
   ملاحظه: من أجل الوضع الأمثل ، يتم استخدام جهاز تثبيت مطبوع ثلاثي الأبعاد ، والذي تم تصميمه لتثبيت العين بثبات ، دون الضغط عليها كثيرا (الشكل 1).
5. استخدم تكبيرا بمقدار 12x وقم بتحويل الإضاءة لتصور طبقات القرنية الفردية.
6. اضبط طاقة النبض (على سبيل المثال ، 1.6 مللي جول) ونقطة التركيز البؤري (على سبيل المثال ، 0.16 مم) للاستئصال الانتقائي للخلايا البطانية.
7. ضع بزل القرنية الشفاف بالقرب من طيفي الأطراف وحقن اللزجة المرنة (جدول المواد) لتثبيت الغرفة الأمامية.
8. استئصال القرنية المركزية المعالجة بالليزر باستخدام تريفين 8 مم.
9. ضع القرنية المستقوصة في بئر من صفيحة مكونة من 12 بئرا بحيث يكون الموقع البطاني متجها لأعلى واحتضان العينة في 3 مل من الوسط الكامل عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
   ملاحظه: يمكن إضافة عوامل الحماية الخلوية المحتملة إلى الوسط خلال هذه الخطوة.

النتائج

الشكل 1: الإعداد التجريبي.(أ) تم تثبيت العيون في جهاز تثبيت مطبوع جزئيا ثلاثي الأبعاد ، مما سمح بمحاذاة دقيقة فيما يتعلق بشعاع الليزر. (ب) قبل العلاج بالليزر ، تم تقييم الأنسجة باستخدام جهاز التصوير المقطعي البصري للتماسك البصري للجزء الأمامي للتحقق من أمراض الجزء الأمامي الرئيسية. يشار إلى مواضع نقاط الليزر البؤرية بنموذج 0.0 مم (علامة النجمة السوداء) و 0.1 مم (علام...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات بارون فراغ تريفين كاتينا ك 20-2058 كرايوستات لايكا سم 3050 ثانية دولبيكو النسر المعدل المتوسط - ارتفاع الجلوكوز جمعية المحاسبين الفلسطينيين E-15009 حامل العين ذات غير متاح مجهر مقلوب لايكا DMI 6000 ب كيه 2 ب 4 ميرك 529568 Na2HPO4 ميرك 1065860500 ليزر Nd: YAG زايس ميديتيك فيسولاس ياغ الثاني بلس OCT الأنسجة تيك ساكورا فاينتكنيك 4583 البنسلين - ستربتومايسين سيجما ألدريتش ص 4333 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) جيبكو 10010056 مصل الخنازير سيجما ألدريتش 12736 ج التصوير المقطعي للتماسك البصري في المجال الطيفي هايدلبرغ الهندسية طيف لوحة زراعة الأنسجة 12 بئر سارستيدت 833921 لزجة مرنة أومني فيجن ميثوسيل