تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. عزل الخلايا البطانية الأبهرية الخنازير
- في ظل ظروف معقمة ، قم بإزالة الشريان الأورطي للخنزير من مخزن الغسيل ، وضعه على طبق بتري مقاس 150 مم (الشكل 1 أ).
- اقطع طرفي الشريان الأورطي برفق واستئصال الأنسجة الزائدة حول الشريان الأورطي باستخدام ملقط معقم ومقص مرة أخرى (الشكل 1 ب). اغسل الجزء الخارجي والداخلي من الشريان الأورطي (فوق طبق المزرعة في درجة حرارة الغرفة) ب 20-50 مل من محلول الغسيل: 1x محلول PBS (درجة الحموضة 7.4) مع 1٪ (حجم / حجم) البنسلين / الستربتومايسين.
ملاحظه: حاول فقط قطع المنطقة التي تم فيها وضع المشابك أثناء الجراحة لأن بعض ECs تضررت في هذه المنطقة ، وقم بإزالة الأنسجة الزائدة والفروع الجانبية الشريانية.
- مرر خياطة جراحية عبر الشريان الأورطي ثم اربط أحد طرفي الشريان الأورطي باستخدام الخيط الجراحي (5-0 ، 90 سم ، جدول المواد). احتفظ بالخياطة الجراحية داخل الشريان الأورطي (الشكل 1 ج ، د).
- قم بإصلاح الشريان الأورطي برفق بالقرب من الطرف المربوط بالملقط ، ثم اسحب الخيط الجراحي ببطء لعكس الشريان الأورطي حتى ينكشف السطح البطاني للشريان الأورطي (الشكل 1E−G).
ملاحظه: تأكد من تثبيت الشريان الأورطي بالقرب من الطرف المربوط ولا تثبت الشريان الأورطي بإحكام ، وإلا فلا يمكن عكس الشريان الأورطي عن طريق سحب الخيط الجراحي.
- اغسل السطح البطاني للشريان الأورطي بمحلول غسيل 3x (10 مل لكل غسلة) ، ثم تخلص من هذا المحلول. ضع الشريان الأورطي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وقم بتغطية الشريان الأورطي ب 10 مل من محلول هضمي 0.005٪ كولاجيناز IV في الأنبوب (الشكل 1H).
ملاحظه: قم بتسخين محلول الجهاز الهضمي 0.005٪ من الكولاجيناز IV مسبقا على حرارة 37 درجة مئوية قبل الهضم.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ضع الشريان الأورطي المهضوم والمحلول الهضمي في طبق مزرعة 100 مم وأوقف تأثيرات 0.005٪ كولاجيناز IV عن طريق إضافة 10-15 مل من المخزن المؤقت المبرد مسبقا: وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مكمل بنسبة 10٪ FBS معطل بالحرارة و 1٪ P / S.
ملاحظه: يتراوح وقت الهضم الموصى به بين 10 و 20 دقيقة. تأكد من تغطية السطح البطاني للشريان الأورطي بالمخزن المؤقت المتوقف.
- اكشط pAECs برفق من السطح الداخلي للشريان الأورطي باستخدام مكشطة خلية (الشكل 1I). اغسل الشريان الأورطي المكشط 3 مرات باستخدام عازلة الغسيل (5 مل لكل مرة). ضع المحلول من طبق الثقافة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. اغسل الجزء السفلي من طبق الثقافة 2x باستخدام عازلة الغسيل (5 مل في كل مرة) ، وضع المحلول في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مرة أخرى.
ملاحظه: اكشط في اتجاه واحد برفق ولا تضغط. لا تلمس الأنسجة بالقرب من الحواف والثقوب. يوصى بالكشط 5-8x.
- قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 600 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واترك 10 مل من المحلول في قاع أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل. أضف 20 مل من عازلة الغسيل إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل وأعد تعليق الكريات. تجنب الفقاعات خلال هذه الخطوة.
- جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق كريات الخلية ب 1 مل من وسط المزرعة واخلطها جيدا.
ملاحظه: متوسط عدد ECs التي تم الحصول عليها لكل سم من الشريان الأورطي هو 1.9 × 10⁵ ± 1.4 × 10⁴ (متوسط ± SD ، ن = 3).
- عد الخلايا بعداد الخلايا. قم بلوحة الخلايا وزراعتها في وعاء دون طلاء أي مواد وفقا لرقم الخلية. إذا كان عدد الخلية أقل من أو يساوي 1.0 × 10⁶ ، فقم بزراعة الخلايا في قارورة مساحتها 25 سم مربع. إذا كان عدد الخلية أكبر من 1.0 × 10 درجة مئوية ، فقم بزراعة الخلايا في عدة قوارير بحجم 25 سم مربع (1.0 × 10 خلايا لكل قارورة). ضع القارورة في حاضنة (بدون رج) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون واستبدل الوسط كل 2-3 أيام.
ملاحظه: تتلف بعض الخلايا بواسطة مكشطة الخلية. وجد مقايسة صلاحية الخلية أن النسبة المئوية للخلايا الحية تبلغ 95.7٪ ± 1.7٪ (متوسط ± SD ، ن = 3). يبلغ وقت مضاعفة الخلايا المعزولة حوالي 1-2 يوم.
