تحميل الخرزة لإدخال الأحماض النووية في الخلايا المزروعة الملتصقة: تقنية لتحميل البلازميدات المشفرة للبروتين الفلوري في خلايا الثدييات الملتصقة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Cialek ، C. A. et al. حبة تحميل البروتينات والأحماض النووية في الخلايا البشرية الملتصقة. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف إجراء إدخال الأحماض النووية في خلايا الثدييات الملتصقة باستخدام تحميل الخرز.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. خلايا تحميل الخرزة

ملاحظة: إذا لزم الأمر ، اغسل الخلايا لفترة وجيزة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثم أضف 2 مل من الوسط الأمثل. احتضن لمدة 30 دقيقة على الأقل.

1. اصنع محلولا من 3-8 ميكرولتر يحتوي على البلازميدات و / أو البروتين و / أو الجسيمات المطلوبة. استخدم ~ 1 ميكروغرام (0.1-1 بليمول) من كل نوع من أنواع البلازميد و ~ 0.5 ميكروغرام (0.01 نانومول) من البروتين ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية. استخدم أنبوبا منخفض الاحتفاظ للبروتينات حتى لا تترك وراءها على جدران الأنبوب. قم برفع المحلول إلى 3 ميكرولتر على الأقل باستخدام PBS ، واضبط حجم المحلول لتغطية منطقة الخلايا المراد تحميلها بالكام....

النتائج

الشكل 1: جهاز تحميل الخرزة والتقنية والجدول الزمني

....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطباق زراعة الخلايا 10 سم VWR 82050-916 استخدم لزراعة الخلايا أطباق زراعة الخلايا 35 مم صقر 353001 استخدم لبناء محمل الخرزة غرفة الخلية الأطلية ثيرمو فيشر العلمي أ 7816 استخدم لإنشاء محمل الخرزة المخصص DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز، بدون جلوتامين ثيرمو فيشر العلمي 11960069 استخدم في زراعة الخلايا العامة أطباق قاع زجاجي ، 35 مم ، # 1.5 ، زجاج 14 مم شركة ماتتك P35G-1.5-14-C خلايا البذور على هذه الغرف للتصوير حبات زجاجية مغسولة بالحمض ≤106 ميكرومتر ميليبور سيجما جي 4649 يرش على الخلايا لتحميل حبة الحمض النووي والبروتينات البلازميد محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرمو فيشر العلمي AM9625 مخزون العمل من معقم 1X PBS DMEM خال من الفينول ثيرمو فيشر العلمي 31053036 استخدمه على الخلايا قبل التصوير Opti-MEM ، مصل متوسط مخفض ثيرمو فيشر العلمي 31985070 الوسائط المثلى لاحتضان الخلايا قبل تحميل الخرزة (خطوة اختيارية)