تحميل الخرزة لإدخال الأحماض النووية في الخلايا المزروعة الملتصقة: تقنية لتحميل البلازميدات المشفرة للبروتين الفلوري في خلايا الثدييات الملتصقة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Cialek ، C. A. et al. حبة تحميل البروتينات والأحماض النووية في الخلايا البشرية الملتصقة. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف إجراء إدخال الأحماض النووية في خلايا الثدييات الملتصقة باستخدام تحميل الخرز.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. خلايا تحميل الخرزة

ملاحظة: إذا لزم الأمر ، اغسل الخلايا لفترة وجيزة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثم أضف 2 مل من الوسط الأمثل. احتضن لمدة 30 دقيقة على الأقل.

1. اصنع محلولا من 3-8 ميكرولتر يحتوي على البلازميدات و / أو البروتين و / أو الجسيمات المطلوبة. استخدم ~ 1 ميكروغرام (0.1-1 بليمول) من كل نوع من أنواع البلازميد و ~ 0.5 ميكروغرام (0.01 نانومول) من البروتين ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية. استخدم أنبوبا منخفض الاحتفاظ للبروتينات حتى لا تترك وراءها على جدران الأنبوب. قم برفع المحلول إلى 3 ميكرولتر على الأقل باستخدام PBS ، واضبط حجم المحلول لتغطية منطقة الخلايا المراد تحميلها بالكامل (على سبيل المثال ، بئر صغير الغرفة ، الشكل 1 ب).
2. امزج المحلول جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل و / أو تحريك الأنبوب. قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة إلى أسفل الأنبوب في جهاز الطرد الدقيق على الطاولة.
3. انقل محلول تحميل الخرزة وحجرة الخلايا إلى غطاء لزراعة الأنسجة. قم بتنفيذ الخطوات المتبقية في غطاء مزرعة الأنسجة باستخدام تقنية معقمة.
4. قم بإزالة الوسيط من الخلايا وتخزينه مؤقتا في أنبوب معقم. قم بشفط كل الوسائط برفق من حول حواف الغرفة وإمالة الغرفة بزاوية 45 درجة تقريبا وقم بإزالة القطرة المتبقية من الوسائط في البئر الصغير المركزي. أثناء الإزالة المتوسطة، تأكد من تجنب ترك طرف الماصة يلمس الزجاج، مما قد يؤدي إلى تقشير الخلايا وفقدانها. انتقل بسرعة إلى الخطوة التالية حتى لا تجف الخلايا لفترة طويلة.
5. قم بوضع ماصة محلول تحميل الخرزة برفق على البئر الزجاجي الصغير في وسط الغرفة. اختياري: احتضن مع هزاز لطيف لمدة ~ 30 ثانية دون السماح للغرفة بالجفاف تماما.
6. قم بتفريق طبقة أحادية من الخرز الزجاجي برفق فوق الخلايا ، ويفضل استخدام جهاز تحميل الخرز (الشكل 1 أ). تأكد من أن الخرزات تغطي الخلايا الموجودة في البئر الزجاجي بالكامل.
7. اضغط على الغرفة بإصبعين ، واضغط عليها على سطح غطاء المحرك عن طريق رفعها ~ 2 بوصة وإسقاطها بإحكام. استخدم قوة تعادل تقريبا إسقاط الطبق من هذا الارتفاع. كرر ما مجموعه ~ 10 نقرات.
   ملاحظه: تأكد من أن الصنابير لا تقشر الخلايا بشكل كبير. يمكن تحسين النقر لنوع الخلية. إذا تم تحميل الخلايا بشكل سيئ ، فانقر بقوة أكبر. ومع ذلك ، إذا تقشرت العديد من الخلايا ، فانقر فوقها بخفة أكبر.
8. أضف الوسيط برفق إلى الغرفة عن طريق سحب العينة ببطء على الجانب البلاستيكي من الغرفة. حاول استنشاق أي حبات عائمة دون إزعاج الخلايا. أضف المزيد من الوسائط التي تم تسخينها مسبقا في هذه الخطوة إذا تمت إزالة الكثير منها. احتضان الخلايا لمدة 0.5-2 ساعة في الحاضنة.

النتائج

الشكل 1: جهاز تحميل الخرزة والتقنية والجدول الزمني

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطباق زراعة الخلايا 10 سم VWR 82050-916 استخدم لزراعة الخلايا أطباق زراعة الخلايا 35 مم صقر 353001 استخدم لبناء محمل الخرزة غرفة الخلية الأطلية ثيرمو فيشر العلمي أ 7816 استخدم لإنشاء محمل الخرزة المخصص DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز، بدون جلوتامين ثيرمو فيشر العلمي 11960069 استخدم في زراعة الخلايا العامة أطباق قاع زجاجي ، 35 مم ، # 1.5 ، زجاج 14 مم شركة ماتتك P35G-1.5-14-C خلايا البذور على هذه الغرف للتصوير حبات زجاجية مغسولة بالحمض ≤106 ميكرومتر ميليبور سيجما جي 4649 يرش على الخلايا لتحميل حبة الحمض النووي والبروتينات البلازميد محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرمو فيشر العلمي AM9625 مخزون العمل من معقم 1X PBS DMEM خال من الفينول ثيرمو فيشر العلمي 31053036 استخدمه على الخلايا قبل التصوير Opti-MEM ، مصل متوسط مخفض ثيرمو فيشر العلمي 31985070 الوسائط المثلى لاحتضان الخلايا قبل تحميل الخرزة (خطوة اختيارية)