توصيل شحنات الحمض النووي القائم على الشفرة النانوية: تقنية لتوصيل مركب Cas9-sgRNA إلى الخلايا المستهدفة عبر جزيئات شبيهة بالفيروسات

الملخص

المصدر: Mangeot, P. E., et al. توصيل مركب البروتين النووي الريبي Cas9 / sgRNA في الخلايا الخالدة والأولية عبر جزيئات شبيهة بالفيروسات ("الشفرات النانوية"). J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية للتوصيل القائم على الشفرة النانوية لمركب البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA داخل الخلايا المستهدفة لتحرير الجينوم. الشفرات النانوية هي جزيئات شبيهة بالفيروسات خالية من القدرة على التكاثر وإصابة الخلايا المجاورة ، وبالتالي فهي مفيدة جدا للنقل السريع والمعتمد على الجرعة للمواد الحيوية والنانوية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. sgRNA تصميم واستنساخ

ملاحظة: يمكن الحصول على إرشادات لتصميم sgRNAs من مصادر متعددة مثل https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing أو من Hanna و Doench.

1. بمجرد تصميم 20 تسلسلات sgRNA للنوكليوتيدات ، اطلب قليل النوكليوتيدات الحمض النووي أحادية الشريطة التالية:
   1. إلى الأمام: 5 'caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N يتوافق مع الموضع المستهدف بدون تسلسل الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM)
   2. العكس: 5 'aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N يتوافق مع المكمل العكسي للموضع المستهدف بدون تسلسل PAM)
      ملاحظه: لا يلزم إجراء تعديلات خاصة عند طلب قليل النوكليوتيدات (لا حاجة إلى فوسفات 5 بوصات).
2. قم بتهجين اثنين من قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) سعة 0.2 مل عن طريق خلط 5 ميكرولتر من محلول التلدين (500 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 100 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك ؛ 100 ملي ملي كلوريد 2 ؛ 10 ملي مولار DTT ؛ درجة الحموضة 7.9 عند 25 درجة مئوية) ، 1 ميكرولتر من كل قليل النوكليوتيد الحمض النووي (محلول مخزون 100 ميكرومتر في الماء) ، و 42 ميكرولتر من الماء.
3. في كتلة PCR ، احتضن العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ثم اخفض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية بمنحدر 0.5 درجة مئوية / ثانية. يحفظ في درجة حرارة الغرفة أو يحفظ عند -20 درجة مئوية
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
4. قم بهضم 10 ميكروغرام من بلازميدات التعبير عن BLADE أو SUPERBLADE sgRNA مع 10 وحدات من إنزيم التقييد BsmBI-v2 لمدة 3 ساعات عند 55 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر.
   ملاحظه: يجب أن يطلق المتجه المهضوم إدراج الحمض النووي ~ 1.9 كيلو بايت وجزء ثان من الحمض النووي ~ 3.3 كيلو بايت.
5. قم بتحميل تفاعل التقييد على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ ملطخ ب 5 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم (أو صبغة هلام بديلة أكثر أمانا).
   ملاحظه: ارتد معدات الحماية المناسبة عند التلاعب ببروميد الإيثيديوم ، الذي يشتبه في تسببه في عيوب وراثية.
   1. على طاولة الأشعة فوق البنفسجية (UV) التي تم ضبطها بطول موجي يبلغ 312 نانومتر (لتجنب إتلاف الحمض النووي) ، قم بقص جزء الحمض النووي 3.3 كيلو بايت من الجل ، وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: ارتد معدات الحماية المناسبة (القفازات ونظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية) عند التلاعب ببروميد الإيثيديوم والعمل على طاولة الأشعة فوق البنفسجية.
   2. استخرج الحمض النووي من شرائح الجل التي تحتوي على جزء الحمض النووي 3.3 كيلو بايت باستخدام مجموعة مخصصة لاستخراج هلام الحمض النووي (انظر جدول المواد). حدد كمية الحمض النووي المنقى باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
6. قم بربط قليل النوكليوتيدات الهجينة للأمام والعكسي من الخطوة 1.2 إلى الشفرات المهضومة ب BsmB1 أو المنقاة بالهلام أو متجه SUPERBLADE من الخطوة 1.5.2. لهذا ، أضف 2 ميكرولتر من T4 DNA ligase buffer ، و 50 نانوغرام من المتجه المنقى بالهلام (من الخطوة 1.5.2) ، و 1 ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات المهجنة للحمض النووي (من الخطوة 1.2) ، والماء لتكوين الحجم إلى 19 ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر من T4 DNA ligase. احتضان التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   1. تحويل منتج الربط إلى بكتيريا مختصة (انظر جدول المواد). ضع البكتيريا المحولة على صفيحة أجار أمبيسلين لوريا بيرتاني واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   2. حدد عدة مستعمرات معزولة على لوحة أجار لإجراء تحضير دقيق للحمض النووي (انظر جدول المواد) ، وقم بإجراء تسلسل Sanger باستخدام برايمر U6 الأمامي (5 'GACTATCATATGCTTACCGT 3') للتحقق من الربط الصحيح لتسلسل متغير sgRNA.
      ملاحظة: يمكن استخدام بلازميدات تعبير sgRNA الأخرى إذا لم تكن ترمز لبروتين Cas9 ، مما قد يتداخل مع إنتاج Nanoblade.

< p class = "jove_title" >2. تحضير البلازميد

1. قم بإجراء التحضير الأقصى (انظر جدول المواد) لجميع البلازميدات المطلوبة ، وقم بإعداد 10 ميكروغرام من البلازميدات عند 1 ميكروغرام / مل لتخزينها عند -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة للبلازميدات ؛ استخدم الحصص مرتين قبل التخلص منها.

فئة

3. تحضير الشفرة النانوية

1. في اليوم الأول ، بذرة بين 3.5 و 4 × 10⁶ خلايا HEK293T (انظر جدول المواد) في 10 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على نسبة عالية من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم و L-glutamine و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين في طبق زراعة خلية 10 سم. حرك اللوحة مقاس 10 سم برفق للخلف وللأمام ، ثم من اليمين إلى اليسار (كرر هذا التسلسل 5x) لتوزيع الخلايا بشكل متجانس على طبق الاستزراع. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالتعامل مع الخلايا المستزرعة والشفرات النانوية تحت غطاء التدفق الصفحي لزراعة الخلايا لتجنب تلوثها.
2. اليوم 2: تعداء البلازميد
   1. يجب أن تكون الخلايا 70-80٪ ملتقية بعد 24 ساعة من الطلاء (الشكل 1 أ). استبدل الوسط ب 10 مل من DMEM الطازج الذي يحتوي على نسبة عالية من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم و L-glutamine و 10٪ FBS (يمكن حذف البنسلين والستربتومايسين على الرغم من أنه ليس إلزاميا) قبل التعدين.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، من المهم ألا تكون الخلايا ملتقية. خلاف ذلك ، يمكن تقليل كفاءة التعدي وكذلك إنتاج الجسيمات.
   2. لكل لوحة مقاس 10 سم ، قم بإعداد الكميات التالية من البلازميدات في أنبوب سعة 1.5 مل: 0.3 ميكروغرام pCMV-VSV-G ، 0.7 ميكروغرام pBaEVRless ، 2.7 ميكروغرام MLV Gag / Pol ، 1.7 ميكروغرام BIC-Gag-Cas9 ، 4.4 ميكروغرام من بلازميد BLADES أو SUPERBLADES الذي يشفر sgRNA المستنسخ (أو 2.2 ميكروغرام لكل منهما إذا كنت تستخدم اثنين من sgRNAs).
   3. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعداء (انظر جدول المواد) ، والدوامة لمدة 10 ثوان ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 1 ثانية. أضف 20 ميكرولتر من كاشف التعدي (انظر جدول المواد) ، وقم بدوامة الأنبوب لمدة 1 ثانية ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 1 ثانية.
   4. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأضف المحلول بالكامل بالتنقيط إلى الخلايا في وسط DMEM باستخدام ماصة P1000. حرك اللوحة مقاس 10 سم برفق للخلف وللأمام ، ثم من اليمين إلى اليسار (كرر هذا التسلسل 5x) لتوزيع كاشف التعدي بشكل موحد على الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 40 ساعة على الأقل في حاضنة خلية مع 5٪ CO₂.
      ملاحظه: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تغيير الوسيط بعد 4 ساعات من التعداد.
3. في اليوم 3 ، تحقق من مورفولوجيا الخلايا المنقولة تحت المجهر.
   ملاحظه: ستبدأ خلايا المنتج في الاندماج. هذا أمر طبيعي بسبب التعبير عن الأظرف الفيروسية الموسوجينية (الشكل 1 ب ، ج).
4. يوم 4: حصاد الشفرات النانوية
   ملاحظه: بعد 40 ساعة على الأقل من التعدي ، كانت الخلايا قد اندمجت معا بسبب التعبير عن الأظرف الفيروسية المغزلية ، وفي بعض الأحيان ، يتم فصل الخلايا تماما عن دعامة اللوحة (الشكل 1 د).
   1. اجمع 9 مل من المادة الطفية المتوسطة باستخدام ماصة سعة 10 مل.
      ملاحظه: الشفرات النانوية هي VLPs قادرة على توصيل بروتين Cas9 والحمض النووي الريبي المرتبط به إلى الخلايا الأولية وفي الجسم الحي. على الرغم من أنها لا تعتبر كائنات معدلة وراثيا لأنها خالية من المواد الوراثية ، إلا أنها يمكن أن تحدث تغييرات جينية. لذلك ، يجب التلاعب بها بحذر لتجنب أي اتصال مع المستخدمين (خاصة إذا تمت برمجتهم لاستهداف الجينات الكابتة للورم). ينصح المستخدمون باتباع إرشادات السلامة المحلية الخاصة بهم للتلاعب بنواقل الفيروسات القهقرية والعمل في مختبر مستوى BSL-2 عند إعداد VLPs وإجراء تجارب التحويل. يمكن تعطيل الشفرات النانوية بنسبة 70٪ من الإيثانول أو 0.5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم. ينصح أيضا بمعالجة جميع النفايات البلاستيكية (أطراف الماصة ، وألواح زراعة الأنسجة ، وأنابيب الطرد المركزي) بنسبة 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10 دقائق على الأقل لتعطيل الشفرات النانوية.
   2. جهاز الطرد المركزي للطافية التي تم جمعها عند 500 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي واستعادة المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية.
      ملاحظة: إذا كان من المفترض استخدام الشفرات النانوية على الخلايا الأولية ، فقم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر أو 0.8 ميكرومتر. اعلم أن هذه الخطوة تقلل بشكل كبير من عيار Nanoblade حيث سيتم حظر جزء كبير في غشاء المرشح.
   3. حبيبات الشفرات النانوية بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) في دوار دلو متأرجح عند 4,300 × جم أو عند 209,490 × جم في جهاز طرد مركزي فائق لمدة 75 دقيقة عند 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا المستهدفة يمكن أن تنمو في DMEM ، فمن الممكن احتضانها مباشرة باستخدام المادة الطافية التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 3.4.2 دون تركيز الشفرات النانوية.
5. يوم 5: إعادة تعليق وتخزين الشفرات النانوية
   1. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسط ببطء وأعد تعليق الحبيبات البيضاء ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS). قم بتغطية الأنبوب بالبارافيلم ، واحتضانه لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف قبل تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
      ملاحظه: قد تظهر مادة بيضاء لزجة عند إعادة التعليق ؛ هذا أمر طبيعي ولا يؤثر بشكل كبير على كفاءة التنبيغ.
   2. قم بتخزين الشفرات النانوية عند 4 درجات مئوية إذا كنت تخطط لاستخدامها في غضون أربعة أسابيع. خلاف ذلك ، قم بتجميد الشفرات النانوية في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية < / > ملاحظة: ارتد نظارات واقية وقفازات مبردة عند التلاعب بالنيتروجين السائل. يؤدي التجميد السريع والتخزين عند -80 درجة مئوية إلى انخفاض كبير في كفاءة Nanoblade. علاوة على ذلك ، لا ينبغي تجميد الشفرات النانوية المذابة مرة أخرى. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

فئة

4. تركيز الشفرات النانوية على وسادة السكروز

ملاحظة: كبديل للطرد المركزي طوال الليل أو الطرد المركزي الفائق (الخطوة 3.4.3) ، يمكن تركيز الشفرات النانوية على وسادة السكروز. ينتج عن هذا جزء أنقى من الشفرات النانوية ، على الرغم من أن الكمية الإجمالية المستردة ستكون أقل.

1. قم بإعداد محلول سكروز بنسبة 10٪ (الوزن إلى الحجم) في 1x PBS ، وقم بتصفيته من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
2. ابدأ عملية تركيز الشفرات النانوية على وسادة السكروز.
   1. ضع 9 مل من العينة المحتوية على VLP (من الخطوة 3.4.3) في أنبوب طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد). باستخدام حقنة وقنية سعة 3 مل ، ضع طبقة ببطء 2.5 مل من السكروز بنسبة 10٪ تحت العينة ، محاولا عدم خلط العينة المحتوية على VLP ومحلول السكروز.
   2. بدلا من ذلك ، ضع 2.5 مل من السكروز بنسبة 10٪ في أنبوب طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد). قم بإمالة الأنبوب وأضف ببطء 9 مل من العينة المحتوية على VLP (من الخطوة 3.4.3) باستخدام ماصة منخفضة السرعة. خلال هذه العملية ، ارفع الأنبوب تدريجيا إلى الوضع الرأسي.
3. الطرد المركزي العينات عند 209,490 × جم في جهاز طرد مركزي فائق لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظه: يمكن تكييف هذه التقنية للطرد المركزي منخفض السرعة (4,300 × جم) بين عشية وضحاها.
4. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وضع الأنبوب رأسا على عقب على المناديل الورقية لإزالة أي سائل متبقي. بعد 1 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS وضع الأنبوب عند 4 درجات مئوية مع غطاء بارافيلم في حامل أنبوب على طاولة تحريض لمدة 1 ساعة (انظر جدول المواد) قبل تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

< p class = "jove_title" >5. مراقبة تحميل Cas9 داخل Nanoblades بواسطة لطخة نقطية

1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتخفيف عن طريق إضافة حجم واحد من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيونية (انظر جدول المواد) في 4 مجلدات من 1x PBS. قم بتخفيف 2 ميكرولتر من الشفرات النانوية المركزة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف ، والدوامة لفترة وجيزة ، ونقل 25 ميكرولتر من هذا الخليط إلى أنبوب جديد يحتوي على 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف. كرر هذه العملية للحصول على 4 أنابيب من تخفيفات Nanoblade (خطوات تخفيف 2 أضعاف).
2. بالنسبة لعناصر التحكم القياسية ، قم بتخفيف 2 ميكرولتر من نوكلياز Cas9 المؤتلف (انظر جدول المواد) إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف ، والدوامة لفترة وجيزة ، واستمر في عمل ثمانية تخفيفات تسلسلية (تخفيف 2 أضعاف لكل خطوة).
3. حدد بعناية 2.5 ميكرولتر من كل تخفيف VLP و 2.5 ميكرولتر من كل معيار على غشاء النيتروسليلوز مع ماصة متعددة القنوات (قد يؤدي الحجم الأكبر إلى تداخل البقع).
   ملاحظه: يمكن أيضا استخدام غشاء بولي فينيل ديفلوريد معالج بالميثانول.
4. بمجرد امتصاص الجسيمات على الغشاء ، قم بسد الغشاء بمحلول ملحي 1x يحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيونية (TBS-T) مكملة بالحليب الجاف الخالي من الدسم (5٪ وزن / حجم) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة ><الغرفة. ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، وتخزين الغشاء عند 4 درجات مئوية في 1x TBS-T.
5. تخلص من 1x TBST المكمل بالحليب الجاف الخالي من الدسم ، واحتضن الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الجسم المضاد Cas9-horseragdish peroxidase (1/1000 تخفيف في 1x TBST ، 5٪ حليب). اغسل الغشاء 3x باستخدام TBS-T ، وتصور الإشارة باستخدام مجموعة ركيزة كيميائية محسنة.
6. حدد كثافة النقطة للشفرات النانوية والتخفيفات القياسية المؤتلفة Cas9 باستخدام البرنامج الاحتكاري المزود بمحطة التصوير الهلامية أو imageJ. حدد منحنى خطي يربط شدة النقطة بتركيز Cas9. باستخدام وظيفة المنحنى الذي تم الحصول عليه ، استقراء محتوى Cas9 في كل مستحضر.
   ملاحظه: يمكن لكمية التحكم في بروتين Cas9 المؤتلف أن تشبع قراءة العينات الأكثر تركيزا من مجموعة التخفيف القياسية (الشكل 2). لذلك ينصح ، عند تحديد المنحنى الخطي ، بإزالة القراءة من العينات غير المخففة (وأحيانا تلك الخاصة بخطوات التخفيف الأولى) إذا لم تكن في النطاق الخطي فيما يتعلق بالتركيز المعروف ل Cas9 الذي تم رصده. وبالمثل ، عند استقراء كمية Cas9 داخل عينات Nanoblade ، استخدم فقط القراءات الموجودة ضمن النطاق الخطي للمنحنى القياسي.

< p class = "jove_title" >6. نقل الخلايا المستهدفة باستخدام الشفرات النانوية (إجراء النقل في صفيحة من 12 بئرا)

1. في صفيحة مكونة من 12 بئرا ، قم ببذور 100,000-200,000 خلية (إما خلايا أولية أو مخلدة) لكل بئر في 1 مل من وسط زراعة الخلايا المناسب. اسمح للخلايا بالالتصاق بسطح اللوحة قبل التنبيغ.
2. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل، أضف 5-20 ميكرولتر من الشفرات النانوية المركزة (من الخطوة 3.5.1 أو 4.4) إلى 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا، واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000. قم بإزالة الوسط من الخلايا ، واستبدله ب 500 ميكرولتر من خليط Nanoblade هذا.
   ملاحظه: يجب تحسين التنبيغ لكل نوع من أنواع الخلايا. من المهم استخدام أصغر حجم ممكن من الوسط (مع تجنب تجفيف الخلايا المستهدفة) بحيث تظل الشفرات النانوية عالية التركيز. يجب تحويل الخلايا الملتصقة مباشرة أثناء توصيلها باللوحة (لا تتحول في التعليق لأن هذا سيقلل بشكل كبير من كفاءة التحويل). تتحمل بعض الخلايا التعرض لفترات طويلة للشفرات النانوية (24-48 ساعة) بينما يكون البعض الآخر حساسا للغاية وقد يشكل مخلوقا صغيرا. في هذه الحالة ، يجب تحضين الشفرات النانوية بالخلايا لمدة 4-6 ساعات فقط قبل استبدال الوسط. يمكن أن يؤدي التطعيم أيضا إلى تحسين التنبيغ للخلايا التي تنمو في معلق. يمكن للمواد المساعدة مثل البوليمرات الموجبة (انظر جدول المواد) أيضا تحسين كفاءة التنبيغ في بعض أنواع الخلايا.
3. بعد 4-6 ساعات من حضانة الخلية في حجم منخفض من الوسط الذي يحتوي على شفرات نانوية ، قم بزيادة حجم المتوسط إلى الكمية الطبيعية (1 مل إذا كنت تعمل مع لوحة 12 بئرا) ، أو استبدلها بوسط جديد إذا كانت الخلايا حساسة ل VLPs.
   ملاحظه: يجب تعطيل وسط الخلية الذي يحتوي على شفرات نانوية بنسبة 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10 دقائق قبل التخلص منه. استخدم القفازات والنظارات الواقية عند التلاعب بهيبوكلوريت الصوديوم. إذا كانت الشفرات النانوية تحفز موت الخلايا ، فقم بتكييف مقدار التعرض والوقت الإجمالي لتقليل وفيات الخلايا.

النتائج

الشكل 1: مورفولوجيا الخلايا المنتجة أثناء إنتاج الشفرة النانوية.(أ) HEK293T الخلايا عند التقاء 70-80٪ بعد 24 ساعة من الطلاء. (ب وج) HEK293T مورفولوجيا الخلية بعد 24 ساعة من التعدين. (د) HEK293T مورفولوجيا الخلية بعد 40 ساعة من التعدي. أشرطة المقياس = 400 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 13.2 مل ، أنابيب البولي بروبيلين رقيقة الجدار ، 14 × 89 مم - 50 بكسل بيكمان كولتر لعلوم الحياة 331372 أنابيب الطرد المركزي الفائق لتنقية الشفرات النانوية أغشية النشاف الغربية الممتازة من Amersham Protran ، النيتروسليلوز ميرك GE10600004 غشاء النيتروسليلوز لقياس مستويات Cas9 داخل الشفرات النانوية المنقاة BIC-Gag-CAS9 أدجين 119942 يشفر اندماج GAG (F-MLV) -CAS9 (SP). يسمح بإنتاج جسيمات شبيهة بفيروس GAG-CAS9 من الخلايا المنتجة بالاشتراك مع الحمض النووي الريبي (الحمض النووي) المعبر عنه والمغلفات المناسبة BICstim-Gag-dCAS9-VPR أدجين 120922 تشفير اندماج GAG-dCAS9-VPR لتنشيط النسخ المستهدف شفرة أدجين 134912 العمود الفقري الفارغ لاستنساخ تسلسل sgRNA لاستخدامه في نظام Nanoblades BsmBI-v2 نيو إنجلاند بيولابيس R0739S إنزيم التقييد لهضم ناقلات BLADE و SUPERBLADES لاستنساخ sgRNA Cas9 (7A9-3A3) ماوس mAb (HRP Conrupgate) # 97982 تقنية إشارات الخلية 97982 ثانية الجسم المضاد المضاد ل Cas9 للقياس الكمي Cas9 بواسطة اللطخة النقطية Cas9 Nuclease ، S. pyogenes نيو إنجلاند بيولابيس M0386T بروتين Cas9 المؤتلف لاستخدامه كمرجع للقياس الكمي المطلق لكمية Cas9 المحملة داخل الشفرات النانوية محلول بروميد الإيثيديوم (10 ملغم/مل في H2O) سيجما ألدريتش E1510-10 مل لتلوين المواد الهلامية الاغاروز وتصور الحمض النووي فيشربراند موجة الحركة الهزازات فيشر ساينتيك 88-861-028 طاولة التحريض لإعادة تعليق الشفرات النانوية عند الطرد المركزي gelAnalyzer http://www.gelanalyzer.com؛ تحديد كثافة الشريط بعد الهضم منتج جيسيكل 293 طن تاكارا 632617 خط الخلية المنتجة للشفرات النانوية جيبكو DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، البيروفات ثيرموفيشر العلمي 41966052 وسط زراعة الخلايا لخلايا Gesicle Producer 293T طقم كاشف الإرسال jetPRIME للحمض النووي والحمض النووي / الحمض النووي الريبي بولي بلس رقم 114-15 كاشف النفقة لإنتاج الشفرات النانوية في خلايا Gesicle Producer 293T Millex-AA ، 0.80 ميكرومتر ، مرشح حقنة ميليبور SLAA033SS مرشح حقنة لإزالة الحطام الخلوي قبل تركيز الشفرات النانوية Millex-GS ، 0.22 ميكرومتر ، مرشح حقنة ميليبور SLGS033SS فلتر حقنة لتعقيم محلول وسادة السكروز Millex-HP ، 0.45 ميكرومتر ، بولي إيثر سلفون ، مرشح حقنة ميليبور SLHP033RS مرشح حقنة لإزالة الحطام الخلوي قبل تركيز الشفرات النانوية طقم استخراج جل الحمض النووي Monarch نيو إنجلاند بيولابيس تي 1020 لتر طقم استخراج هلام الحمض النووي لتنقية pBLADES أو جزء البلازميد pSUPERBLADES عند الهضم باستخدام BsmBI NEB مستقرة المختصة بكتريا قولونية (كفاءة عالية) نيو إنجلاند بيولابيس C3040I البكتيريا المختصة لتحويل البلازميد وتضخيمه مجموعة NucleoBond Xtra Midi للحمض النووي البلازميد من الدرجة النفقة ماشيري ناجل 740410.5 مجموعة Maxipreparation لتنقية الحمض النووي البلازميد من البكتيريا المستنبتة طقم استخراج Nucleospin gDNA ماشيري ناجل 740952.5 استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا المنقولة NucleoSpin Plasmid ، مجموعة صغيرة للحمض النووي البلازميد ماشيري ناجل 740588.5 مجموعة تحضير مصغرة لتنقية الحمض النووي البلازميد من البكتيريا المستنبتة NucleoSpin Tissue ، مجموعة صغيرة للحمض النووي من الخلايا والأنسجة ماشيري ناجل 740952.5 طقم استخراج الحمض النووي الجيني أوبتيما XE-90 بيكمان كولتر لعلوم الحياة أ94471 جهاز طرد مركزي فائق pBaEVRless إلس فيرهوين (Inserm U1111) يجب إرسال الطلبات الشخصية إلى: els.verhoyen@ens-lyon.fr Baboon الفيروس القهقري الداخلي Rless البروتين السكري الموصوف في Girard-Gagnepain، A. et al. يتفوق غلاف Baboon على VSV-G-LVs لنقل الجينات إلى HSCs المحفزة بالسيتوكين المبكر والمريحة. الدم 124, 1221–1231 (2014) pBS-CMV-gagpol أدجين 35614 Enocdes فيروس سرطان الدم الفئران هفوة وجينات pol pCMV-VSV-G أدجين 8454 [م] بروتين الغلاف لإنتاج جزيئات الفيروسات القهقرية والفيروسات القهقرية MuLV محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر العلمي 14200091 10X PBS للتخفيف في ماء مليبور كاشف تعداء البوليبرين ميليبور سيجما TR-1003-G بوليمر كاتيوني يعزز كفاءة نقل الفيروسات القهقرية في خلايا ثدييات معينة. يمكن أن يسمح أيضا بالدخول المعتمد على الفيروس لقليل الأكسجين نيوكليوتيد (ODN) للإصلاح الموجه بالتماثل السكروز ، للبيولوجيا الجزيئية ، ≥99.5٪ (GC) سيجما ألدريتش S0389-5 كجم السكروز لتحضير وسادة لتنقية الشفرات النانوية من خلال الطرد المركزي الفائق SUPERBLADE5 أدجين 134913 العمود الفقري الفارغ لاستنساخ تسلسل sgRNA لاستخدامه في نظام الشفرات النانوية (محسن لزيادة كفاءة تحرير الجينوم عبر Chen B et al. ، 2013) SuperSignal West Dura الركيزة ذات المدة الممتدة ثيرموفيشر العلمي 34076 ركيزة HRP للتلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) لبقع Cas9 النقطية SW 41 Ti دوار دلو متأرجح بيكمان كولتر لعلوم الحياة 331362 الدوار للطرد المركزي الفائق SYBR صبغة جل الحمض النووي الآمنة ثيرموفيشر العلمي S33102 بديل لبروميد الإيثيديوم لتلوين المواد الهلامية الاغاروز وتصور الحمض النووي T4 DNA Ligase نيو إنجلاند بيولابيس M0202S DNA ligase لربط نواقل BLADE أو SUPERBLADES مع oligos الحمض النووي المزدوج المقابل للمنطقة المتغيرة من sgRNA عازلة التحلل المحتوية على Triton بروميجا E291A المخزن المؤقت للتحلل لتعطيل الشفرات النانوية والسماح بالقياس الكمي ل Cas9 توين 20 سيجما ألدريتش ص 9416 لإعداد TBST