مقالة منهجية

الحقن المجهري لجنين البعوض: تقنية لتوصيل الحمض النووي الخارجي إلى صفار الجنين من Anopheles Gambiae لتوليد طفرات السلالة الجرثومية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Carballar-Lejarazú ، R. et al ، طريقة الحقن المجهري لأجنة Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نوضح توصيل محرك الجينات في جنين بعوضة Anopheles gambiae من خلال تقنية الحقن المجهري للجنين. يسمح هذا الإجراء بدمج بنية الحمض النووي التي يتم تسليمها ، من خلال إعادة التركيب المتماثل ، في خلايا السلالة الجرثومية لتوليد مجموعات البعوض المتحولة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = "jove_title" >1. الحقن المجهري للأجنة

  1. استخدم طرف اللودر الصغير لملء الإبر ب 2 ميكرولتر من خليط الحمض النووي (الحمض النووي البلازميدي بتركيز 300-400 نانوغرام / ميكرولتر. أدخل الإبرة في حامل الإبرة وقم بتوصيل أنبوب مضخة الضغط الآلي (الشكل 1).
  2. هام: قم بمحاذاة الإبرة بحيث تصنع زاوية 15 درجة مع مستوى الشريحة (الشكل 1).
  3. افتح طرف الإبرة عن طريق لمس البويضة الأولى من بعوضة Anopheles gambiae بعناية وحقنها عن طريق إدخال طرف الإبرة ≤ 10 ميكرومتر في القطب الخلفي. سيؤدي الحقن الناجح إلى حركة صغيرة للسيتوبلازم داخل البويضة.
  4. استخدم أدوات التحكم في المرحلة المحورية في المجهر للانتقال إلى البويضة التالية لمواصلة الحقن.
    1. للتأكد من أن طرف الإبرة يظل مفتوحا وعدم انسداده، اضغط على زر الحقن قبل دخول جنين آخر وتصور القطرة الصغيرة عند فتحة الإبرة.
    2. إذا انسدت الإبرة ، اضغط على زر مسح لمسح الإبرة وكرر اختبار تصور القطيرات. اضبط الضغط حسب الحاجة إذا أصبحت فتحة طرف الإبرة أكبر قليلا لضمان بقاء حجم القطرة صغيرا.
    3. حقن ~ 40-50 بيضة بإبرة واحدة.
      ملاحظه: تأكد من بقاء ورق الترشيح رطبا في جميع الأوقات. حافظ على الضغط الخلفي الكافي على الإبرة لإبقائها نظيفة. يجب استبدال الإبرة التي لا يمكن فكها بإبرة جديدة. أصبح وضع الجنين وإدخال الإبرة والحقن أسهل باستخدام المجاهر التي تحتوي على عناصر تحكم متحدة المحور للحركة الأفقية للمرحلة (الشكل 2).
  5. بعد اكتمال الحقن ، اشطف البيض في وعاء زجاجي مبطن بورق ترشيح ومملوء ب 50 مل من H2O منزوع الأيونات (الشكل 3).< / > ملاحظه: ستبدأ الأجنة في الفقس بعد يومين من الحقن وقد تستغرق ما يصل إلى 3-5 أيام. يجب نقل يرقات الطور الأول المفرغة على الفور (تحقق مرتين يوميا) إلى وعاء نظيف به ماء وطعام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: وضع الإبرة أثناء الحقن المجهري. أ) عرض بزاوية عريضة لمرحلة الحقن. ب ، ج) ضع الإبرة بحيث تشكل الأجنة المحاذاة زاوية 15 درجة بإبرة الحقن. لا ترفع ذراع أداة الحقن المجهري التي تحمل الإبرة أعلى بكثير من مرحلة المجهر لضمان الزاوية المناسبة بين الإبرة والشريحة التي تحتوي على الأجنة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10x عازلة الحقن المجهري - - 1 ملي مولار NaHPO4 عازلة ، درجة الحموضة 6.8 ، 50 ملي كلوريد البكلوريوس غشاء النشاف (غشاء النشاف الجينومي Zeta-Probe GT) بيو راد مقطعة بدقة وبشكل مستقيم إلى قطعة 2 × 1 سم الماء المقطر منزوع الأيونات أو المقطر المزدوج (ddH20) ميلي كيو في زجاجة غسيل تشريح المجهر لايكا لايكا MZ12 لمحاذاة الأجنة حاوية زجاجية بيركس رقم 3140 125 س 65 شريحة زجاجية فيشر براند رقم 12-549-3 75 × 26 ملم حاقن دقيق أداة سوتر حاقن XenoWorks الرقمي Microinjector أطراف ماصة Microloader إيبندورف 20 ميكرولتر محمل دقيق epT.I.P.S. معالج دقيق أداة سوتر XenoWorks Micromanipulator ماصة دقيقة رينين 20 ميكرولتر مجهر لايكا DM 1000 LED أو M165 FC للحقن المجهري شبكة النايلون فرشاة الطلاء نفض الغبار رقم 05831-7040 فاين، مقاس 4/0 طبق بتري بلاستيك (60 × 15 مم ، 90 × 15 مم)

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Yolk

مقالات ذات صلة