توصيل الجينات الهيدروديناميكية: تقنية لنقل الحمض النووي الخارجي في الجسم الحي في خلايا الكبد الفئرانية عن طريق حقن وريد الذيل

الملخص

المصدر: Hubner، E. K. et al.، الأنظمة التأسيسية والتحفيزية للتعديل الجيني في الجسم الحي لخلايا الكبد في الفئران باستخدام حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو تقنية التعدي الجيني في الجسم الحي لخلايا الكبد الفئرانية عن طريق حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي. يولد نظام التعدي هذا تعبيرا طويل الأمد عن الجين المعدل في خلايا الكبد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحضير الحل لحقن وريد الذيل الهيدروديناميكي

ملاحظة: قم بإعداد تركيبات البلازميد للتعبير الجيني التأسيسي والمحفز عن طريق تقنية الاستنساخ باستخدام البكتيريا المختصة.

1. تحضير محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ للحقن (لا تستخدم PBS). استخدم الحجم المقابل لحوالي 10٪ من وزن جسم الفأر. مثال: بالنسبة للفأر الذي يزن 20 جراما ، قم بإعداد 2 مل من المحلول.
2. تحضير نواقل الحقن التي تم تنقيتها باستخدام مجموعة تنقية البلازميد الخالية من السموم الداخلية.
3. أضف 10 ميكروغرام أو 15 ميكروغرام من بنية ناقلات الجمال النائم الخالية من السموم الداخلية (استخدم 10 ميكروغرام ، من الخطوة 4 استخدم 15 ميكروغرام ، على التوالي) و 1 ميكروغرام من pc-HSB5 الخالي من السموم الداخلية لكل مل من محلول ملحي معقم.
4. قم بتخزين المحلول لمدة تصل إلى 4 ساعات عند 4 درجات مئوية. لا تجمد.

2. إجراء حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي

1. استخدم مصفاة لحقن وريد الذيل (تجاري أو محضر من أنبوب مخروطي سعة 50 مل به فتحات للتنفس وللذيل). املأ الجزء السفلي من الأنبوب بالمناديل الورقية.
2. للحقن ، استخدم الفئران التي يبلغ عمرها حوالي 8-10 أسابيع بأوزان 20-25 جم.
3. قم بوزن الفئران قبل الحقن وقم بإعداد حجم الحقن وفقا لوزن الجسم (المقابل 10٪ من وزن الجسم). تحضير حقنة معقمة 3 مل بإبرة 27 جم للحقن وتعبئتها بالحجم المطلوب.
4. ضع الماوس في المصفاة. اضبط كمية المناديل الورقية لترك مساحة صغيرة فقط للحركة ولكن مساحة كافية للتنفس.
5. تأكد من أن الفأر يتنفس بانتظام.
6. قم بتسخين الذيل باستخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء لمدة 30-60 ثانية. راقب بعناية علامات ارتفاع درجة الحرارة.
7. نظف الذيل بمسحة كحولية.
8. أدخل الإبرة أفقيا تقريبا في أحد العروق الجانبية القريبة من قاعدة الذيل.
   ملاحظه: إذا تم وضعه بنجاح، فقد تتدفق كمية صغيرة من الدم مرة أخرى إلى مخروط الإبرة. لا ينصح بالشفيق بنشاط لأن أي حركة إضافية للإبرة يمكن أن تؤدي إلى إزاحتها و / أو إصابة الوريد.
9. حقن الحجم الكلي في وريد الذيل في غضون 8-10 ثوان.
10. قم بإزالة الماوس على الفور من المصفاة. ضغط جرح الحقن لمدة 30 ثانية على الأقل أو حتى يهدأ أي نزيف.
11. ضع الماوس في قفص منفصل. بمجرد أن يتعافى الماوس من الإجراء (حوالي 30-60 دقيقة) ، انقل الماوس مرة أخرى إلى قفصه الأصلي. تحقق من الماوس بانتظام لمدة 24 ساعة < / > القادمة ملاحظه: لوحظ تخدير خفيف للفأر بشكل روتيني لمدة تصل إلى ساعتين بعد الحقن.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الصوديوم 0,9٪ براون 3200905 ناقل للحقن في الوريد فالكون أنبوب مخروطي 50 مل كورنينج لعلوم الحياة 352095 مصباح الأشعة تحت الحمراء غير متاح غير متاح لتسخين ذيل الفأر البلازميدات لاستنساخ ناقلات الينقولات الجميلة النائمة ل HTVI. الاتصالات الطرفية غير متاح ناقل للتعبير الجيني التأسيسي pEN_TTmcs أدجين #25755 ناقل الدخول للتعبير الجيني المحفز pEN_TTGmiRc2 أدجين #25753 متجه الإدخال لتعبير miRshRNA المحفز مع التعبير المشترك ل GFP pEN_TTmiRc2 أدجين #25752 متجه الإدخال لتعبير miRshRNA المحفز بدون تعبير مشترك عن GFP pTC ApoE-Tet أدجين #85578 ناقل التعبير للجين المحفز أو تعبير miR-shRNA باستخدام ApoE.HCR.hAAT promotor pTC-CMV-Tet أدجين #85577 ناقل التعبير للجين المحفز أو تعبير miR-shRNA مع محفز CMV