مقالة منهجية

التحول الجيني بوساطة Agrobacterium: طريقة لتحويل جينوم الأرز وراثيا عن طريق Agrobacterium tumefaciens المعدلة وراثيا

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Xu ، D. ، et al. التحول الجيني بوساطة agrobacterium ، والإنتاج المعدل وراثيا ، وتطبيقه لدراسة التطور التناسلي للذكور في الأرز. J. Vis. Exp. (2020).

في هذا الفيديو ، نوضح التحول الجيني لجينوم الأرز باستخدام ناقل ثنائي Agrobacterium tumefaciens. تسهل هذه البكتيريا نقل بلازميد الحمض النووي الغريب باستخدام بروتينات الفوعة Agrobacterium.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. التحول الجيني للأرز وزراعة الأنسجة النباتية

  1. تحريض الكالس وتجديده
    ملاحظه: استخدم نورات الأرز الصغيرة الطازجة كمادة أولية للحث على الكالس (الشكل 1).
    1. اجمع النورات الصغيرة من حقل الأرز أو البيت الأخضر في مرحلة الانقسام الاختزالي ، والتي تحددها طول الزهرة من 1.6 إلى 4.8 مم (الشكل 1 أ). تأكد من تغطية أزهار الأرز بغمد الأوراق. امسح كل نورة بقطعة كحول بنسبة 70٪ واتركها تجف قبل تقطيعها.
    2. أحضر الإزهار إلى مقعد معقم نظيف. قم بتقطيعها إلى قطع صغيرة (كلما كان أصغر كان ذلك أفضل) بمقص معقم ثم انقل القصاصات إلى صفيحة بتري تحتوي على وسط NBD2 (الشكل 1 ب ، الجدول 1).
    3. احتضن اللوحة في الظلام عند 26 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما للحث على الكالس (الشكل 2 أ).
      ملاحظه: استخدم الكالس المشكل حديثا لتسلل Agrobacterium (الخطوة 1.2.7) مباشرة أو أعد التجديد مرة أخرى في وسط NBD2 الجديد للحصول على المزيد من الكالو. انقل الكالس إلى وسيط NBD2 الجديد كل 8-10 أيام.
  2. التحول والزراعة المشتركة
    1. استخدم A. tumefaciens البكتيريا التي تحتوي على البلازميد الثنائي مع بناء sgRNA-CAS9 للتحول. قم بتخزين سلالات A. tumefaciens في وسط YEB (الجدول 1) مع 50٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.
    2. Streak A. tumefaciens من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية إلى وسط أجار YEB الذي يحتوي على مضادات حيوية انتقائية (الجدول 1) وينمو عند 25-28 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة ، للسماح للمستعمرات بالظهور.
    3. تلقيح مستعمرة واحدة من لوحة YEB بالمضادات الحيوية الانتقائية إلى 5 مل من وسط YEB السائل الذي يحتوي على نفس المضادات الحيوية الانتقائية (الجدول 1) ، في أنبوب اختبار معقم مخروطي الشكل سعة 50 مل. رج العبوة على شاكر مداري عند 250 × جم ، عند 25-28 درجة مئوية حتى تنمو البكتيريا إلى OD600 من 0.5.
    4. أضف 1 مل من المعلق البكتيري إلى 100 مل من وسط YEB (الجدول 1) مع نفس المضادات الحيوية الانتقائية في قارورة مخروطية سعة 250 مل ورجها على شاكر مداري عند 250 × جم ، عند 28 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    5. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع البكتيريا. تخلص من المادة الطافية.
    6. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية باستخدام وسيط AAM-AS (الجدول 1) وقم بتخفيف التعليق إلى OD600 = 0.4.
      ملاحظه: يعد OD المثالي للتعليق البكتيري أمرا بالغ الأهمية للتحويل الفعال. يساعد في القضاء على نمو البكتيريا الزائد على الكالو.
    7. اجمع حوالي 150 كالي جنيني هش أصفر فاتح صحي من الخطوة 1.1.3 إلى قارورة معقمة سعة 150 مل. أضف 50-75 مل من تعليق الخلايا البكتيرية من الخطوة 1.2.6 في القارورة المعقمة ، ثم أضف حوالي 10-25 مل من وسط AAM-AS الطازج لغمر الكالي لمدة 10-20 دقيقة ، مع رجها من حين لآخر.
    8. اسكب المعلق البكتيري من القارورة بعناية وجفف المعلق البكتيري الزائد من الكالس باستخدام ورق ترشيح معقم # 1 أو مناديل ورقية. ثم ضعها على طبق بتري مع متوسط NBD-AS (الجدول 1) مغطى بورق ترشيح معقم # 1. احتضن عند 25-28 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 أيام وتحقق من فرط نمو البكتيريا.
  3. اختيار الكالس المقاوم
    1. بعد 3 أيام من الزراعة المشتركة ، انقل الكالي إلى طبق بتري معقم بورق ترشيح معقم.
    2. جفف الكالي بالهواء لمدة ساعتين على مقعد نظيف. تأكد من عدم التصاق الكالس بورق الترشيح.
    3. انقل الكالي بالتساوي باستخدام ملاقط معقمة إلى وسط الاختيار الأولي NBD2 (مع 40 مجم / لتر هيغروميسين و 250 مجم / لتر timentin) (الجدول 1). ثقافة الكالي لمدة أسبوعين عند 25-28 درجة مئوية في الظلام.
    4. بعد أسبوعين ، انقل الكالي بالتساوي إلى طبق جديد يحتوي على وسط اختيار طازج NBD2 (مع 40 مجم / لتر هيغروميسين و 250 مجم / لتر timentin) (الجدول 1). استزراع الكالي لمدة أسبوعين آخرين عند 25-28 درجة مئوية في الظلام.
  4. تمايز الكالس
    1. انقل الكالس إلى MS Medium الطازج (مع 25 مجم / لتر hygromycin و 150 مجم / لتر timentin) (الجدول 1). استزراع تحت الضوء عند 25-28 درجة مئوية لمدة أسبوعين تقريبا.
    2. كرر الخطوة 1.4.1 مرة أخرى.
    3. انقل براعم التصوير إلى وسط MS الجديد (مع 10 مجم / لتر hygromycin) لتكاثر المزيد من البراعم.

الجدول 1: تركيبات الوسائط لتحويل الأرز. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مواد أولية لحث الكالس. (أ) أزهار الأرز الصغيرة في مرحلة الانقسام الاختزالي. (ب) تشريح النورات الصغيرة التي تنمو على وسط NBD2. شريط = 2 سم في (A).

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-2
الشكل 2: إجراء إنتاج الخطوط المعدلة وراثيا عن طريق التحول بوساطة Agrob...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T DNA

مقالات ذات صلة