توصيل الجينات في المختبر بوساطة التثقيب الكهربائي: تقنية نبضة كهربائية لإدخال بلازميدات ترميز البروتين الفلورية في الخلايا المستنبتة

الملخص

المصدر: Lo ، J. C. W. et al. ، طريقة التثقيب الكهربائي الفعالة والفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على الأهداب في سلائف الخلايا الحبيبية.J. Vis. Exp.(2021)

يوضح هذا الفيديو تقنية التثقيب الكهربائي التي تقدم الحمض النووي البلازميد المشفر للبروتين الفلوري في سلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية للفأر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التثقيب الكهربائي للإفراط في التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا لمستقبلات Hh: pEGFP-Smo

1. للتثقيب الكهربائي باستخدام كوفيت فجوة 2 مم ، قم بإعداد خليط التثقيب الكهربائي لخلايا البلازميد التالي لكل تفاعل للتثقيب الكهربائي: 1.2 × 10⁶ خلايا سلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية للفأر و 10 ميكروغرام من pEGFP-mSmo (اضبط تركيز مخزون الحمض النووي إلى ~ 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت Tris-EDTA أو dH_{المعقم 2}O) في 100 ميكرولتر من Opti-MEM.
   ملاحظه: قلل العدد الإجمالي للخلايا إذا كانت الخلايا غير كافية (على الرغم من أن هذا قد يقلل من كفاءة التثقيب الكهربائي). ومع ذلك ، لا تقم بضبط كمية البلازميد ولا الحجم الإجمالي ل Opti-MEM المستخدم لكل كوفيت. إذا تجاوز العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة للتجربة 1.5 × 10⁶ خلايا ، فقم بتوسيع نطاق خليط التثقيب الكهربائي وفقا لذلك وقم بإجراء تفاعلات متعددة للتثقيب الكهربائي بشكل منفصل. يمكن إعادة استخدام الكوفيت حتى 5 مرات.
2. قم بإعداد صفيحة بذر الخلايا بعد التثقيب الكهربائي عن طريق إضافة 0.5 مل من وسط الاستزراع إلى كل بئر من لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على أغطية مغلفة واحتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂. لتحضير أغطية لربط الخلية ، احتضان أغطية زجاجية معقمة مقاس 12 مم مع 100 ميكروغرام / مل من بولي دي ليسين (PDL ، 1 مجم / مل في dH₂O) معقمة لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية. احتفظ بالقطاعات في نفس محلول PDL عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
3. قم بعرض العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل وقم بالدوران عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من Opti-MEM. كرر هذه الخطوة مرتين باستخدام Opti-MEM لضمان عدم وجود وسيط ثقافة متبقي في الأنبوب.
   ملاحظه: لكل بئر / غطاء لصفيحة 24 بئرا ، التثقيب الكهربائي والبذور 1.2-1.3 × 10⁶ خلايا / بئر للحصول على ~ 70-75٪ من التقاء الخلايا في اليوم التالي من الثقافة.
4. اضبط معلمات التثقيب الكهربائي كما هو موضح في الجدول 1.
5. ماصة تفاعل التثقيب الكهربائي برفق لخلط جيدا واستخدم طرفا طويلا من P200 لنقل حجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر من الخليط إلى كوفيت الفجوة 2 مم. تجنب تكوين الفقاعات.
6. ضع الكوفيت في حجرة الكوفيت.
7. اضغط على الزر Ω الخاص بالمثقب الكهربائي (انظر جدول المواد) وقم بتدوين قيمة المعاوقة ، والتي يجب أن تكون ~ 30-35. لضمان Ω تقع قيمة المعاوقة الكهربائية في نطاق 30-35 ، التزم بحجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر.
8. اضغط على زر البدء لبدء النبض.
9. سجل قيم التيار المقاس والجول الموضحة على إطار القراءة.
10. أخرجي الكوفيت من حجرة الكوفيت.
11. أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا إلى الكوفيت وأعد تعليقه عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. انقل تعليق الخلية على الفور إلى الصفيحة المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على أغطية مغلفة معدة في الخطوة 1.2.
    ملاحظه: لتقليل موت الخلايا ، قم بزرع الخلايا مباشرة بعد التثقيب الكهربائي.
12. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂. اترك الخلايا دون إزعاج لمدة 3 ساعات لتجنب انفصال الخلايا.
13. بعد 3 ساعات من البذر ، قم بالشفط برفق والتخلص من نصف الوسط الطافي لإزالة الخلايا الميتة العائمة والحطام واستبداله بنفس الكمية من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا.
14. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂.

إعداد نبض التثقيب إعداد نبض النقل GCPs الأساسية للماوس الخلايا العصبية الأولية GCPs الأساسية للماوس الخلايا العصبية الأولية ضغط 275 فولت 275 فولت 20 فولت 20 فولت طول 1 مللي ثانية 0.5 مللي ثانية 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية فترة 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية 50 مللي ثانية لا. 2 2 5 5 معدل D 10٪ 10٪ 40٪ 40٪ قطبيه + + ± ±

الجدول 1: معلمات التثقيب الكهربائي ل GCPs الأولية للفأر والخلايا العصبية الأولية باستخدام Super Electroporator NEPA21 TYPE

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 لايف تكنولوجيز المحدودة 17504044 GlutamMAXTM-I ، 100x جيبكو ، لايف تكنولوجيز 35050061 بديل L-glutamine ماتريجيل BD Biosciences 354277 مصفوفة الغشاء القاعدي العصبي العصبي جيبكو ، لايف تكنولوجيز 21103049 بولي دي ليسين هيدروبروميد سيجما ألدريتش ص 6407 CU 500 غرفة كوفيت نيباجين CU500 كوفيت التثقيب الكهربائي EPA (فجوة 2 مم) نيباجين EC-002 أوبتي-ميم لايف تكنولوجيز المحدودة 31985070 وسط مصل منخفض للتعداء pEGFP-mSmo أدجين هاتف: 25395 سوبر المثقور الكهربائي NEPA21 TYPE II في المختبر وفي الجسم الحي نيباجين NEPA21 المثقاب الكهربائي