توصيل الجينات في المختبر بوساطة التثقيب الكهربائي: تقنية نبضة كهربائية لإدخال بلازميدات ترميز البروتين الفلورية في الخلايا المستنبتة

الملخص

المصدر: Lo ، J. C. W. et al. ، طريقة التثقيب الكهربائي الفعالة والفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على الأهداب في سلائف الخلايا الحبيبية.J. Vis. Exp.(2021)

يوضح هذا الفيديو تقنية التثقيب الكهربائي التي تقدم الحمض النووي البلازميد المشفر للبروتين الفلوري في سلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية للفأر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التثقيب الكهربائي للإفراط في التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا لمستقبلات Hh: pEGFP-Smo

1. للتثقيب الكهربائي باستخدام كوفيت فجوة 2 مم ، قم بإعداد خليط التثقيب الكهربائي لخلايا البلازميد التالي لكل تفاعل للتثقيب الكهربائي: 1.2 × 10⁶ خلايا سلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية للفأر و 10 ميكروغرام من pEGFP-mSmo (اضبط تركيز مخزون الحمض النووي إلى ~ 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت Tris-EDTA أو dH_{المعقم 2}O) في 100 ميكرولتر من Opti-MEM.
   ملاحظه: قلل العدد الإجمالي للخلايا إذا كانت الخلايا غير كافية (على الرغم من أن هذا قد يقلل من كفاءة التثقيب الكهربائي). ومع ذلك ، لا تقم بضبط....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 لايف تكنولوجيز المحدودة 17504044 GlutamMAXTM-I ، 100x جيبكو ، لايف تكنولوجيز 35050061 بديل L-glutamine ماتريجيل BD Biosciences 354277 مصفوفة الغشاء القاعدي العصبي العصبي جيبكو ، لايف تكنولوجيز 21103049 بولي دي ليسين هيدروبروميد سيجما ألدريتش ص 6407 CU 500 غرفة كوفيت نيباجين CU500 كوفيت التثقيب الكهربائي EPA (فجوة 2 مم) نيباجين EC-002 أوبتي-ميم لايف تكنولوجيز المحدودة 31985070 وسط مصل منخفض للتعداء pEGFP-mSmo أدجين هاتف: 25395 سوبر المثقور الكهربائي NEPA21 TYPE II في المختبر وفي الجسم الحي نيباجين NEPA21 المثقاب الكهربائي