مقالة منهجية

نوة أشكال الطفيليات: طريقة تعداء قائمة على التثقيب الكهربائي لتوصيل بلازميدات ترميز البروتين الفلوري إلى نواة البوغية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Duan، C.، et al. Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria الطفيليات. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نصف nucleofection ، وهو إجراء تعداء قائم على التثقيب الكهربائي لتوصيل الحمض النووي البلازميد المشفر بالبروتين الفلوري إلى شكل sporozoite من طفيلي Eimeria الدجاج.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نوة الميروزويت أو البوغية

  1. التحضير قبل نوة الطفيليات
    1. تحضير حوالي 107 ميروزويت أو سبوروزويت في أنبوب واحد. في حالة نقل الميروزويت ، قم بإعداد 3-4 أنابيب.
    2. قم بإعداد كمية من الحمض النووي البلازميد أو جزء PCR المنقى أكبر من أو يساوي 10 ميكروغرام
      ملاحظه: يحتوي البلازميد المستخدم في هذه الدراسة على جينين: بروتين الفلورسنت الأصفر المعزز (EYFP) وثنائي هيدروفولات ريدكتيز ثيميديلات سينسيز المشتق من التوكسوبلازما جوندي (TgDHFR-TS).
    3. تحضير 25 وحدة من إنزيم التقييد. إذا كانت البلازميدات خطية ، يمكن لإنزيم التقييد تحسين كفاءة التعداد. إذا كانت البلازميدات دائرية ، فاحذف إنزيم التقييد.
    4. قم بإعداد 85 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنواة (الجدول 1): امزج 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت النووي الأول و 1 مل من المخزن المؤقت للنواة II واستخدم جزءا من المحلول. حجم المخزن المؤقت الكلي هو 100 ميكرولتر.
  2. النواة
    1. جهاز الطرد المركزي لتعليق sporozoite أو merozoite عند 600 × جم لمدة 10 دقائق. ثم تخلص من الطافف.
    2. بالترتيب التالي ، أضف 85 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعداء النووي ، و 10 ميكروغرام من البلازميد (جزء PCR) ، و 25 وحدة من إنزيم التقييد (عادة 5 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل يحتوي على sporozoites أو merozoites.
    3. انقل المعلق إلى كوب تعداء نووي. ضع الكوب في أخدود نقل نووي.
    4. قم بتشغيل جهاز النواة باستخدام زر الطاقة وحدد إجراء التعداء U-033. إذا بدأ جهاز النواة في وضع اختيار البرنامج المجاني ، فقم بإنهاء هذا الوضع بالضغط على الزر X.
    5. عند انتهاء البرنامج ، اضغط على الزر X الخاص بجهاز nucleofection ، ويجب أن تعرض الشاشة موافق ، مما يشير إلى نجاح النواة.
    6. أضف 0.5-1 مل من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) إلى كوب النواة لإيقاف التفاعل ونقل المعلق إلى أنبوب 1.5 مل بعد الخلط برفق.
مخزن مؤقت

تكوين

المخزن المؤقت Nucleofection I ATP-ثنائي الصوديوم 2 جم ، MgCl2-6H 2O 1.2 جم ، 10 مل ماء المخزن المؤقت Nucleofection II KH2PO4 6 جم ، NaHCO3 0.6 جم ، جلوكوز 0.2 جم ، 500 مل ماء * الماء: الماء المقطر

الجدول 1: تكوين المخازن المؤقتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM ماكجين CM15019 جهاز Nucleofection لونزا / أماكسا 90900012 (Nucleofector II) الجلوكوز سيغما رقم V900116 ATP-ثنائي الصوديوم سيغما أ26209 السليلوز DE-52 سولاربيو سي 8350 KH2PO4 سيغما رقم V900041 أجهزة الطرد المركزي منخفضة السرعة بكين عصر بيلي الطرد المركزي المحدودة DT5-2 مغنكلوريد2 سيغما 449164 NaHCO3 سيغما 144-55-8 برنامج تلفزيوني سولاربيو ص 1010 سورفال ليجند مايكرو 17 جهاز طرد مركزي دقيق ثيرموفيشر العلمي 75002430 التربسين سولاربيو تي 8150 Percoll (حل مخزون التدرج DG) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-0891-09

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة