$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. قم بإزالة الخلايا الركامية من البويضات المخصبة.
- تحت المجهر المجسم ، استخدم 2 حقنة الأنسولين: الأولى لتثبيت قناة البيض والثانية لتمزيق الأمبولة وتفريق البويضات المخصبة في محلول عمل الهيالورونيداز.
- خذ الماصة الزجاجية المحضرة لجمع البيض وقم بتوصيلها بالأنبوب وفلتر 0.22 ميكرومتر مثبت على قطعة الفم لشفط كل البيض. اجمع كل البيض واغسلها عن طريق المرور المتتالي إلى 6 قطرات مختلفة من 100 ميكرولتر من M2 متوسط.
- ضع البيض المخضع المغسول في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في وسط M16.
< p class = "jove_title" >
2. صنع ماصات الحقن
- استخدم أنابيب شعرية زجاجية رقيقة الجدران (بطول 10-15 سم) بقطر خارجي يبلغ 1 مم وقم بتثبيت هذه الشعيرات الدموية في مجتذب ماصة دقيقة أفقية.
ملاحظه: في معظم ساحبات الماصات الأفقية، يمكن ضبط 3 معلمات: الطاقة الحرارية وقوة السحب والتأخير الزمني بين التسخين والسحب. اضبط هذه المعلمات للحصول على ماصات حقن تشبه تلك المعروضة في الشكل 1 أ. بالنسبة للمستخدمين الذين يقومون بإجراء الحقن المجهري للحمض النووي بشكل روتيني، استخدم الإعدادات القياسية واضبط التأخير بين التسخين والسحب لتغيير الشكل العالمي لطرف الماصة.
< p class = "jove_title" >
3. صنع ماصات القابضة
- استخدم ماصة حقن لتحضير الماصة المثبتة.
- قم بتوصيل ماصة الحقن بجهاز microforge. قم بقص الماصة باستخدام microforge للحصول على طرف متماثل حاد بقطر 80 إلى 100 ميكرومتر. ثم قم بتلميع الطرف بالحرارة على microforge للحصول على شكل دائري متماثل بدون تحوطات حادة.
< p class = "jove_title" >
4. تحضير ماصة الحقن التي تحتوي على ناقل الفيروس العسسي
- جهاز الطرد المركزي معلق ناقل الفيروسات عند 160 × جم لمدة دقيقتين إلى حطام الحبيبات الموجود غالبا في مخزونات الفيروسات العدسية المجمدة.
- استرجع المادة الطافية وانقله إلى أنبوب جديد سعة 0.5 مل في خزانة أمان من الفئة الثانية.
- انقل 1 ميكرولتر من المادة الطافية إلى ماصة حقن محضرة كما هو موضح في الخطوة 5 باستخدام محمل دقيق.
- اضبط ماصة الحقن على حامل العدادات الخاص بجهاز المعالجة الدقيقة الأيمن. قم بتوصيل ماصة التثبيت بالملاعب الدقيقة اليسرى.
ملاحظه: ويرتبط المعدل التنبيغي للناقل الفيروسي العسسي ارتباطا مباشرا بفعالية إنتاج المؤسس. للحصول على فعالية عالية (>70٪) ، استخدم نواقل فيروسية ذات عيار في حدود 100 نانوغرام من بروتين القفيصة p24 / ميكرولتر. عندما يتم التعبير عن العيار كوحدات تحويل (TU) ، يجب أن يكون العيار أعلى من 109 TU / mL. يجب إنتاج مخزونات ناقلات الفيروسات العدسية عن طريق تعداء عابر لخلايا 293T مع بلازميد التغليف p8.91 ، pHCMV-G ، الذي يشفر البروتين السكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) كما هو موضح في الطرق التكميلية.
فئة < ص = "jove_title" >
5. الحقن الدقيق
- قم بتوزيع 8 ميكرولتر من وسط M2 في وسط شريحة الاكتئاب وقم بتغطيتها بزيت البارافين الخفيف (تم اختبار الجنين) لتجنب التبخر.
- ضع 20 بيضة في القطرة بأقل قدر ممكن من التشتت.
أنذر: لا تصنع فقاعات عند إيداع الأجنة.
- تأكد من أن طرف ماصة الحقن مفتوح. إذا لم يكن الأمر كذلك، فاضغط على ماصة الحقن باستخدام الماصة القابضة.
- اضبط الحاقن الدقيق على وقت حقن يبلغ 20 ثانية < / >
ملاحظه: تسمح لزوجة المعلق الفيروسي بالتصور الواضح لتشتت الناقل الفيروسي في الفضاء المحيطي. يجب ضبط ضغط الحقن لملء الفراغ بالكامل في غضون 20 ثانية من الحقن ، وهو ما يمثل حجما من 10 إلى 100 pL. يجب ألا يتجاوز ضغط الحقن 600 هيكتوباسكال.
- استنشق بويضة مخصبة واحدة تحتوي على 2 نواة و 2 أجسام قطبية باستخدام الماصة القابضة تحت المجهر المجسم.
- حقن البويضة بالحاقن الدقيق في مساحة perivitelline.
أنذر: لا تلمس غشاء البلازما بماصة الحقن.
- حقن جميع البويضات المخصبة المتوفرة على دفعات من 20 بيضة ووضع البويضات المحقونة على الفور في وسط M16 مسخن مسبقا في الحاضنة المرطبة 37 درجة مئوية مع جو 5٪ CO2.
ملاحظه: احتضان البويضات المحقونة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة بعد الحقن قبل نقل الأجنة.
