فئة
1. ثقب بيض الفأر المخضع باستخدام ليزر XYClone
- قم بإعداد ومعايرة ليزر XYClone وفقا لتوصية الشركة المصنعة. يمكن استبدال أنواع الليزر الأخرى ، التي تستخدم عادة في الإخصاب في المختبر ، بليزر XYClone لتثقيب البويضات المخصبة.
- قم بتوصيل سلك صندوق التحكم بالليزر بجهاز الليزر على المجهر.
- قم بتوصيل صندوق التحكم بالليزر بالكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل برنامج الليزر عبر منفذ USB. 3.1.3. قم بتوصيل وحدة التحكم بالليزر وتشغيلها.
- بالنظر من خلال العدسة ، قم بثقب عينة اختبار (مثل علامات المسح الجاف على شريحة زجاجية).
- استخدم مفك براغي صغير (مضمن في مجموعة الليزر) لضبط موضع X و Y لليزر ليتناسب مع ضوء LED المرئي من خلال عدسة المجهر ومعايرة الليزر.
- ضع صفيحة إسقاط KSOM تحتوي على بيض مخصب بالفأر على مرحلة المجهر. لا تحتفظ باللوحة خارج الحاضنة لمدة تزيد عن 15 دقيقة.
- انظر من خلال عدسة المجهر وتأكد من أن المنطقة الشفافة للجنين في بؤرة التركيز وأن ضوء الليزر LED مرئي.
- حرك مرحلة المجهر لاستهداف المنطقة بضوء LED / الليزر.
- باستخدام برنامج الكمبيوتر ، قم بتعيين ليزر XYClone على 250 ميكرو ثانية.
- اضبط حجم ضوء LED على الأبعاد المطلوبة (الإعداد 5 في هذه التجربة).
- ثقب منطقة كل بويضة مخصبة ثلاث مرات بالليزر. يمكن أن تكون المنطقة إما مثقوبة أو ضعيفة. باستخدام الإعدادات المذكورة أعلاه ، سينتج الليزر ثقبا بقطر 10 ميكرومتر (الشكل 1). < / >
ملاحظه: التصويب بالقرب من الجسم القطبي يبقي الليزر بعيدا عن الخلية الجنينية.
- اترك البيض المخصب يتعافى لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الأنسجة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
فئة
2. نقل البويضات المخصبة للفأر بعد ثقب ليزر XYClone
- Pipet 2 ميكرولتر من فيروس العدسات المركز (أكبر من 1e8 TU / mL عيار) في قطرة 50 ميكرولتر KSOM. لا تسحب لأعلى ولأسفل. يرتبط البيض المخخص بسهولة بطرف الماصة. بناء على تجربتنا ، فإن وحدات تحويل الفيروس 1e5-5e5 بحجم أقل من 3 ميكرولتر هي الأمثل لإيصال الجينات.
- اترك البويضات المخصبة تتطور إلى كيسة أريمية لمدة 4 أيام في الحاضنة. لا حاجة لتغيير وسائل الإعلام.
< p class = "jove_title" >3. النقل غير الجراحي لأجنة الفئران المنقولة إلى الفئران الحوامل الزائفة
- استخدم الفئران الحوامل الزائفة بعد 3.5 يوم من التزاوج.
- استخدم جهاز نقل الأجنة غير الجراحي (NSET) لزرع أجنة الفئران في الفئران الحوامل الزائفة.
- باستخدام مجهر جراحي أو تشريح ، أدخل منظار مهبلي لتصور عنق الرحم.
- أدخل جهاز نقل الأجنة غير الجراحي (NSET) حوالي 5 مم في عنق الرحم وقم بإيداع الأجنة بحجم 2 ميكرولتر ><تقريبا.
ملاحظه: يتم استخدام جهاز NSET معقم لكل عملية نقل ويتم التخلص منه بعد العملية. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة في التلاعب بالأجنة معقمة.
- نقل 10-15 كيسة أريمية صحية بحجم 2 ميكرولتر من KSOM إلى كل فئران حامل كاذبة.
- استمر في مراقبة وقياس زيادة الوزن في الفئران الحوامل الزائفة في الأيام التالية لتحديد ما إذا كان اختبار الالتهاب غير العاطفي ناجحا أم لا.
- استرجع الجراء عن طريق السماح للفئران الحامل بالولادة بشكل طبيعي أو إجراء عملية قيصرية بعد 17 يوما من نقل الأجنة. غالبا ما تكون الولادة القيصرية ضرورية إذا كان هناك عدد قليل جدا من الأجنة ونمت بشكل كبير جدا بحيث لا يمكن الولادة الطبيعية.
- اجمع الأنسجة من الجراء للتنميط الجيني لتحديد معدل الانتقال.
