< p class = "jove_title" >
1. تحضير الحمض النووي
- قم بإعداد أقراص بيولوجية برتقالية عن طريق غمرها في 100٪ من الإيثانول باستخدام الملقط. ضع الأقراص في طبق بتري كبير يحتوي على المجفف حتى يجف (تأكد من أن المجفف لا يلمس الأقراص).
- بمجرد أن يجف ، اضغط على أقراص الناقل الكبير في حاملات الأقراص الفضية (التي تم مسحها مسبقا بالإيثانول بنسبة 100٪).
- حبات الناقل الذهبي الدوامة معلقة في 100٪ من الإيثانول و aliquot 12 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، أنبوب واحد لكل تحويل.
- أضف إلى كل أنبوب بالترتيب: 2 ميكروغرام من الحمض النووي (يفضل 2 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي) ، 10 ميكرولتر 2.5 م كلور كالسبير2 ، و 2 ميكرولتر 1 م قاعدة خالية من السمبيرميدين.
- قم بإعداد عنصر تحكم سلبي كما في الخطوة 1.4 ولكن بدون وجود DNA.
- قم بتدوير كل أنبوب واحتضانه في درجة الحرارة المحيطة لمدة 5 دقائق.
أنابيب - تدور عند 225 × جم لمدة 30 ثانية لحبيبات الخرز الذهبي المطلي بالحمض النووي. قم بإزالة المادة الطافية بعناية (عن طريق سحب العينة أو الشفط) وتخلص منها.
- أعد تعليق الخرزات تماما في 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ عن طريق سحب العينات ببطء لأعلى ولأسفل.
- أنابيب الدوران عند 225 × جم لمدة 30 ثانية لحبيبات الخرز دون تعبئة. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية.
- أعد تعليق حبيبات الذهب المطلية بالحمض النووي في 8 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ عن طريق سحب العينة ببطء لأعلى ولأسفل.
- ماصة الخرز الذهبي المطلي بالحمض النووي على وسط القرص الحيوي بقطر 1 سم واتركه حتى يجف. < br / >
ملاحظه: تشير دائرة الذهب المجفف المرئية في وسط القرص الحيوي إلى وجود تركيز كاف من حبات الذهب.
ملاحظه: أصبحت أقراص الناقل الكبير المحملة بخرز ذهبي مطلي بالحمض النووي جاهزة الآن للاستخدام مع مسدس الجينات.
< p class = "jove_title" >
2. تشغيل مسدس الجينات
- قم بتشغيل مضخة التفريغ.
- قم بتشغيل غاز الهيليوم عن طريق تدوير المقبض عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى ضغط يبلغ حوالي 2,200 رطل لكل بوصة مربعة على مقياس الضغط.
- قم بتشغيل مسدس الجينات عن طريق قلب المفتاح الأحمر على اليسار.
- تأكد من ضبط معدلات تدفق المكنسة الكهربائية وفتحة التهوية بحيث تصل المكنسة الكهربائية إلى 28 بوصة زئبق في غضون 15 ثانية.
- تأكد من أن المسافة بين قرص التمزق والناقل الكبير تبلغ حوالي 3/8 بوصة.
- نظف الغرفة بأكملها عن طريق المسح بالإيثانول.
- اغمر أقراص التمزق في الإيثانول بنسبة 100٪. اتركيه ليجف على سطح معقم (على سبيل المثال ، طبق بتري).
- استخدم مفتاح عزم الدوران لفك حامل قرص التمزق. أدخل قرص تمزق نظيف في الحامل. قم بربط حامل قرص التمزق مرة أخرى في مكانه وشدها بمفتاح عزم الدوران عن طريق تدويره مرة واحدة إلى اليمين.
ملاحظه: سيتم استبدال أقراص التمزق بعد كل لقطة.
- اغمر الشاشات الشبكية في 100٪ من الإيثانول. اتركيه ليجف على سطح معقم (على سبيل المثال ، طبق بتري).
- بمجرد أن يجف ، ضع شاشة شبكية مغسولة على لوحة التثبيت البلاستيكية البيضاء. ضع جانب الحمض النووي لحامل قرص الحامل الكبير لأسفل في حجرة القرص. قم بربط الغطاء الفضي ، وضع لوحة التثبيت في أعلى فتحة. < / >
ملاحظه: سيتم استبدال الشاشة الشبكية بعد كل لقطة.
- ضع صفيحة أجار YPD تحتوي على 1 متر من السوربيتول على اللوحة السفلية.
- أغلق باب الغرفة وأغلقه في مكانه.
- ادفع مع الاستمرار المفتاح الأحمر الأوسط لأعلى لإشراك الفراغ والسماح للمكنسة الكهربائية بالوصول إلى 28 بوصة زئبق. بمجرد الوصول إلى مستوى الفراغ المناسب ، انقل هذا المفتاح إلى الوضع السفلي. عندما تصبح جاهزا ، اضغط باستمرار على المفتاح الأحمر على اليمين لإطلاق النار. عندما ينبثق قرص التمزق ، حرر زر النار على الفور وادفع المفتاح الأحمر الأوسط إلى الموضع الأوسط لتنفيس الغرفة إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة.
- قم بتنظيف بقايا القرص الممزق وإيقاف تشغيل مسدس الجينات. ثم قم بإيقاف تشغيل غاز الهيليوم عن طريق تدوير المقبض في اتجاه عقارب الساعة ، وأخيرا ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ.
