$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. طلاء طبق بولي أورنيثين / لامينين (Po / L)
ملاحظة: يتم تكييف الأحجام لتغليف صفيحة 24 بئرا.
- إذا لزم الأمر ، ضع غطاء معقم مقاس 12 مم في البئر.
- قم بتغطية الآبار ب 500 ميكرولتر من محلول 10 ميكروغرام / مل من محلول Poly-L-Ornithine المذاب في الماء.
- دع الآبار تستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- قم بإزالة محلول Poly-L-Ornithine وجففه في الهواء لمدة 30 دقيقة.
- قم بتغطية الآبار طوال الليل عند 37 درجة مئوية ب 500 ميكرولتر من 3 ميكروغرام / مل لامينين في بيكربونات L-15.
ملاحظه: يمكن تخزين الآبار عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام في الحاضنة. بالنسبة للحضانات الطويلة ، يمكن أن تساعد إضافة PBS معقمة بين الآبار في تجنب التبخر المتوسط.
< p class = "jove_title" >
2. ثقافة الخلايا العصبية الحركية
- قم بتخفيف MNs إلى الكثافة المناسبة ، عادة من 5,000 إلى 10,000 خلية في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل بئر في صفيحة 24 بئرا.
ملاحظه: تبلغ كثافة البذر حوالي 30,000 و 1,500 خلية لألواح 6 و 96 بئرا ، على التوالي.
- قم بإزالة محلول اللامينين باستخدام P1000.
- انقل شبكات MN المخففة في وسط الاستزراع على الفور إلى ألواح الطلاء لتجنب الجفاف.
- احتضان المزرعة لمدة يومين عند 37 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >
3. Magnetofection للخلايا العصبية الحركية
ملاحظة: في الخطوات التالية ، تهدف الكميات المستخدمة إلى تعداء بئر واحد من صفيحة 24 بئرا. يرجى الرجوع إلى بروتوكول الشركة المصنعة للحصول على تنسيق آخر.
- لتحضير الحمض النووي ، أعد تعليق 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميكرولتر من وسط الثقافة العصبية والدوامة لمدة 5 ثوان. هنا ، يتم استخدام بلازميدات 9 كيلو بايت مع محرك CAGGS (pCAGEN) الذي يتحكم في الحيوط العصبية.
- لتحضير أنبوب الخرزة ، أعد تعليق 1.5 ميكرولتر من الخرز في 50 ميكرولتر من وسط الثقافة العصبية.
- أضف محلول الخرزة سعة 50 ميكرولتر إلى محلول الحمض النووي سعة 50 ميكرولتر واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الحجم الإجمالي = 100 ميكرولتر).
- خلال هذه الحضانة ، اسحب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع من البئر الذي سيتم نقله.
ملاحظة: ضع اللوحة المغناطيسية في الحاضنة لتسخينها إلى 37 درجة مئوية.
- انقل 100 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي / الخرزة إلى البئر ، واحتضان اللوحة لمدة 20-30 دقيقة على اللوحة المغناطيسية عند 37 درجة مئوية.