نقل الجينات بوساطة الفيروسات القهقرية: تقنية نقل الجينات لإيصال جين محول في الخلايا المستنبتة باستخدام نواقل الفيروسات القهقرية المهندسة

الملخص

المصدر: Jacquier، A. et al. نمذجة مرض شاركو ماري توث في المختبر عن طريق نقل الخلايا العصبية الحركية الأولية للفأر. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح تعداء الحمض النووي البلازميد الموجه مغناطيسيا في زراعة الخلايا العصبية الأولية. يستخدم Magnetofection مجالا مغناطيسيا خارجيا لتوجيه توصيل البلازميدات المرتبطة بالجسيمات النانوية المغناطيسية إلى سيتوبلازم الخلية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد بناء الفيروسات القهقرية

1. استنساخ فرعي لسلاسل ألفا وبيتا لمستقبلات الخلايا التائية (TCR) ، مفصولة بوصلة 2A ، في ناقل فيروسي قهقري قائم على MSCV (على سبيل المثال ، pMIAII أو pMIGII).
   ملاحظه: يسمح الرابط 2A بالتعبير المتكافئ والمتوافق مع سلاسل ألفا وبيتا TCR من إطار قراءة واحد مفتوح. يشتمل المتجه على كاسيت بروتين فلوري IRES (أميترين أو GFP) يستخدم لتتبع الخلايا المنقولة وكفاءة التحويل.
2. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة أدوات إعداد البلازما التي تم الحصول عليها تجاريا أو منتج مشابه. استخدم تركيز عمل 1-2 ميكروغرام ^{ميكرولتر -1}.

< p class = "jove_title" >2. تولي....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز + الجلوتامين كورنينج سيلجرو 10-013-السيرة الذاتية تعديل Dulbecco لوسط النسر ب 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine وبيروفات الصوديوم FBS أتلانتا البيولوجية S11550 تربسين فيرسين لونزا 17-161 فهرنهايت مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر الترمو: العلمية 194-2545 بوليبرين سيغما H9268-10G معقم مفلتر في dH2O سيبروفلوكساسين VWR AAJ61970-06 بيروفات الصوديوم كورنينج سيلجرو 25-000-CI الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM كورنينج سيلجرو 25-025-CI محلول HEPES 1 M كورنينج سيلجرو 25-060-CI ل-جلوتامين كورنينج سيلجرو 25-005-CI أطباق زراعة الأنسجة 150 مم غرينر بيو ون 639160 لوحة مسطحة 6 آبار معالجة بالثقافة Tisue غرينر بيو ون 657160 مصافي خلايا النايلون 70 ميكرومتر صقر هاتف: 352350 الماوس IL-3 إنفيتروجين PMC0033 IL-6 البشري إنفيتروجين PHC0063 عامل الخلايا الجذعية للفأر إنفيتروجين PMC2113L 10x PBS كورنينج سيلجرو 46-D13-سم هانكس عازلة كورنينج سيلجرو 21020147 د.ب 10 مل حقنة دينار بحريني 300912 حقنة 1 مل دينار بحريني دينار بحريني 309659 27 جم × 1/2 BD إبرة انزلاق دقيقة دينار بحريني 305109 30 جم × 1/2 دينار بحريني إبرة انزلاقية دقيقة دينار بحريني 305106