نقل الجينات بوساطة الفيروسات القهقرية: تقنية نقل الجينات لإيصال جين محول في الخلايا المستنبتة باستخدام نواقل الفيروسات القهقرية المهندسة

الملخص

المصدر: Jacquier، A. et al. نمذجة مرض شاركو ماري توث في المختبر عن طريق نقل الخلايا العصبية الحركية الأولية للفأر. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح تعداء الحمض النووي البلازميد الموجه مغناطيسيا في زراعة الخلايا العصبية الأولية. يستخدم Magnetofection مجالا مغناطيسيا خارجيا لتوجيه توصيل البلازميدات المرتبطة بالجسيمات النانوية المغناطيسية إلى سيتوبلازم الخلية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد بناء الفيروسات القهقرية

1. استنساخ فرعي لسلاسل ألفا وبيتا لمستقبلات الخلايا التائية (TCR) ، مفصولة بوصلة 2A ، في ناقل فيروسي قهقري قائم على MSCV (على سبيل المثال ، pMIAII أو pMIGII).
   ملاحظه: يسمح الرابط 2A بالتعبير المتكافئ والمتوافق مع سلاسل ألفا وبيتا TCR من إطار قراءة واحد مفتوح. يشتمل المتجه على كاسيت بروتين فلوري IRES (أميترين أو GFP) يستخدم لتتبع الخلايا المنقولة وكفاءة التحويل.
2. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة أدوات إعداد البلازما التي تم الحصول عليها تجاريا أو منتج مشابه. استخدم تركيز عمل 1-2 ميكروغرام ^{ميكرولتر -1}.

< p class = "jove_title" >2. توليد خطوط الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية

1. استخدم عملية من خطوتين لإنتاج خطوط الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية.
   1. قم بتوليد الفيروسات القهقرية عن طريق التعداء العابر لخلايا 293T بثلاثة بلازميدات (pVSVG و pEQ-Pam3 (-E) والناقل ذي الأهمية) وأخذ المادة الطافية القهقرية من خلايا 293T لتحويل خط الخلية المنتج للفيروسات القهقرية البيئية GP + E86.
   2. اعزل أعلى 40٪ من الخلايا المنتجة للفلورسنت التي تعبر عن GP + E86 بواسطة FACS ونشر الخلايا المنتجة المنقولة-GP + E86 كمصدر للفيروس.
      ملاحظه: يعد توليد منتجين عالي العيار أمرا بالغ الأهمية للنقل الفعال لخلايا نخاع العظام.

< p class = "jove_title" >3. نقل جيني الخلايا الجذعية بوساطة الفيروسات القهقرية (اليوم -5)

1. قم بإذابة الثلج والاستزراع 0.5 -1.0 × 10⁶ من كل خط خلية منتج GP + E86 في DMEM الكامل 10٪ (vol / vol) FBS للسماح بنمو كاف للوحين ملتقبين مقاس 150 مم بحلول اليوم 0 من هذا البروتوكول.
   ملاحظه: سيسمح ذوبان الجليد 0.5 - 1.0 × 10⁶ من كل خط خلية منتج GP + E86 في صفيحة مقاس 10 سم بالتقاء 30-50٪ في اليوم الخامس. يسمح هذا أيضا ب 5 أيام من الاستزراع من أجل توسيع خطوط الخلايا المنتجة GP + E86 إلى لوحين ملتقيين مقاس 150 مم بحلول اليوم 0.
   1. مزرعة خط الخلايا المنتج للفيروسات القهقرية في وسط زراعة الأنسجة الكامل الذي يحتوي على 5٪ مصل عجل الجنين ، وسيبروفلوكساسين (10 ميكروغرام / مل) لتجنب تلوث الميكوبلازما.
      ملاحظه: توقف عن استخدام سيبروفلوكساسين عند إنتاج المادة الطافية الفيروسية لنقل نخاع العظام. تجنب الإفراط في نمو خط الخلايا المنتجة ، لأن ذلك سيؤثر سلبا على كفاءة نقل نخاع العظام.

< p class = "jove_title" >4. ثقافة الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية (اليوم 0)

1. اللوحة 3 × 10⁶ خلايا منتجة للفيروسات القهقرية لكل صفيحة 150 مم في 18 مل DMEM كامل 20٪ (vol / vol) FBS.
2. احتضان الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. توقع صفيحة واحدة مقاس 150 مم ل 15 مليون خلية نخاع عظمي (حوالي 2-3 فئران متبرعة).

< p class = "jove_title" >5. طافي الفيروسي القهقري (اليوم 1)

1. في اليوم التالي (بعد حوالي 24 ساعة) ، قم بحصاد المادة الطافية الفيروسية القهقرية من ألواح المنتج (التي تم إعدادها في الخطوة 4) عن طريق رسم المادة الطافية الفيروسية القهقرية مباشرة من اللوحة مقاس 150 مم باستخدام حقنة 10 مل ومرشح باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.
2. استبدل المادة الطافية الفيروسية القهقرية التي تمت إزالتها بعناية ب 18 مل من DMEM 20٪ (vol/vol) FBS.
3. استكمل المادة الطافية الفيروسية القهقرية المفلترة ب IL-3 (20 جم ^{مل -1}) و IL-6 (50 جم ^{مل -1}) و MSCF (50 جم ^{مل -1}) و Hexadimethrine bromide (Polybrene) (6 ميكروغرام ^{مل -1}).
   ملاحظه: يجب أن يكون بروميد سداسي ديميثرين طازجا كل شهرين لتجنب انخفاض فعالية نقل الفيروسات القهقرية.

< p class = "jove_title" >6. طافي الفيروسات القهقرية والتنبيغ (اليوم 2)

1. بعد 24 ساعة ، اجمع المادة الطفية الفيروسية الطازجة من خط الخلايا المنتجة للفيروس. قم بتصفية المادة الطافية الفيروسية القهقرية باستخدام حقنة سعة 10 مل وفلتر حقنة 0.45 ميكرومتر. استكمل المادة الطافية المرتبة للفيروسات القهقرية المفلترة ب IL-3 (20 جم ^مل-1) و IL-6 (50 جم ^مل-1) و SCF (50 جم ^مل-1) و Hexadimethrine bromide (6 جم ^مل-1).
2. بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء العلوي من 2 مل من الوسائط بعناية باستخدام ماصة أو استنشق أعلى 2 مل من الوسائط من كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار تحتوي على خلايا نخاع العظم.
   ملاحظه: اعمل بحذر حتى لا يتم شفط نخاع العظام ، والذي يتركز عادة في منتصف البئر. بدلا من ذلك ، يمكن غزل المادة الطافية التي تمت إزالتها لاستعادة أي خلايا نخاع عظمي مفقودة.
3. أضف إلى كل بئر في صفيحة نخاع العظم المكونة من 6 آبار 3 مل من المادة الطافية الفيروسية الطازجة التي تحتوي على السيتوكينات وبروميد سداسي ديميثرين. لف الألواح بالبلاستيك وكرر نقل الدوران عند 1,000 × جم لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية. قم بفك الألواح واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها (حوالي 24 ساعة).

< ص الفئة = "jove_title" >7. إضافة DMEM الطازج المكملة (اليوم 3)

1. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة أعلى 2 مل من الوسائط من كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار تحتوي على خلايا نخاع العظم ، كما في الخطوة 6.2. يستعاض عن الوسائط التي تمت إزالتها ب DMEM 20٪ (حجم/حجم) FBS طازج مكمل بتركيزات نهائية من IL-3 (20 جم ^مل-1) و IL-6 (50 جم م^ل-1) و SCF (50 جم ^مل-1).
2. احتضان ألواح نخاع العظم عند 37 درجة مئوية حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 24 ساعة أخرى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز + الجلوتامين كورنينج سيلجرو 10-013-السيرة الذاتية تعديل Dulbecco لوسط النسر ب 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine وبيروفات الصوديوم FBS أتلانتا البيولوجية S11550 تربسين فيرسين لونزا 17-161 فهرنهايت مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر الترمو: العلمية 194-2545 بوليبرين سيغما H9268-10G معقم مفلتر في dH2O سيبروفلوكساسين VWR AAJ61970-06 بيروفات الصوديوم كورنينج سيلجرو 25-000-CI الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM كورنينج سيلجرو 25-025-CI محلول HEPES 1 M كورنينج سيلجرو 25-060-CI ل-جلوتامين كورنينج سيلجرو 25-005-CI أطباق زراعة الأنسجة 150 مم غرينر بيو ون 639160 لوحة مسطحة 6 آبار معالجة بالثقافة Tisue غرينر بيو ون 657160 مصافي خلايا النايلون 70 ميكرومتر صقر هاتف: 352350 الماوس IL-3 إنفيتروجين PMC0033 IL-6 البشري إنفيتروجين PHC0063 عامل الخلايا الجذعية للفأر إنفيتروجين PMC2113L 10x PBS كورنينج سيلجرو 46-D13-سم هانكس عازلة كورنينج سيلجرو 21020147 د.ب 10 مل حقنة دينار بحريني 300912 حقنة 1 مل دينار بحريني دينار بحريني 309659 27 جم × 1/2 BD إبرة انزلاق دقيقة دينار بحريني 305109 30 جم × 1/2 دينار بحريني إبرة انزلاقية دقيقة دينار بحريني 305106