تلطيخ الزيت الأحمر O: تقنية لتلوين الدهون المحايدة في خلايا الكبد للكشف عن التنكس الدهني الكبدي في المختبر

الملخص

المصدر: Campos-Espinosa، A. et al. ، نموذج للتنكس الدهني التجريبي في المختبر: ثقافة خلايا الخلايا الكبدية في وسط مكيف بالحمل الزائد للدهون. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح تلطيخ الدهون المحايدة في المختبر في خلايا الكبد للكشف عن التنكس الدهني الكبدي أو التراكم المفرط للدهون في الكبد. تتراكم الدهون الزائدة في الخلايا على شكل قطرات دهنية. Oil Red O هي صبغة قابلة للذوبان في الدهون ترتبط بالدهون المحايدة داخل الخلايا في قطرات الدهون هذه. عند ملاحظتها تحت المجهر الضوئي ، تظهر قطرات الدهون داخل الخلايا حمراء اللون بشكل مكثف.

البروتوكول

فئة

1. تلطيخ الدهون بالزيت الأحمر O

1. ضع غطاء لزراعة الخلايا في كل بئر في طبق مكون من 24 بئرا.
2. بذرة 100,000 خلية HepG2 لكل بئر. أضف 1 مل من RPMI 1640 القياسي.
3. احتضان مسبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
4. قم بتغيير وسيط RPMI 1640 القياسي للوسط الشوهي.
5. احتضن لمدة 24 ساعة ، 2 أيام ، 3 أيام ، و 4 أيام ، مع تحديث الوسط التنقيم كل 24 ساعة.
6. بعد الوقت المناسب ، تخلص من المادة الطافية.
7. يغسل ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تخلص من المادة الطافية.
8. إصلاح مع 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS.
9. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
10. تخلص من فائض بارافورمالدهايد.
11. شطف الخلايا مع 1 مل من الماء المقطر.
12. أضف 1 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 70٪ واحتضنه لمدة 5 دقائق.
13. تخلص من فائض الأيزوبروبانول. ليست هناك حاجة إلى غسل PBS في هذه المرحلة.
14. أضف 1 مل من محلول Oil-red O واحتضنه لمدة 30 دقيقة.
15. تخلص من فائض محلول Oil-red O
16. اشطفه ب 1 مل من الماء المقطر.
17. أضف 500 ميكرولتر من محلول الهيماتوكسيلين. احتضن لمدة 3 دقائق.
18. تخلص من فائض محلول الهيماتوكسيلين.
19. اشطفه ب 1 مل من الماء المقطر.
20. راقب تحت المجهر بتكبير 400x (الهدف 40x ، العين 10x).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الإعلام الثقافي RPMI 1640 ThermoFisher-Gibco ، الولايات المتحدة 31800-022 - مصل الأبقار الجنينية (FBS) ThermoFisher-Gibco ، الولايات المتحدة A4766801 - خط خلايا HepG2 ATCC ، الولايات المتحدة إتش بي -8065 الخلايا البشرية لسرطان الخلايا الكبدية. حاضنة مرطب شركة ثيرمو الالكترونية ، الولايات المتحدة الموديل: 3110 درجة الحرارة (37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) ، الرطوبة (90٪ ± 5٪) ، ثاني أكسيد الكربون (5٪ ± 1٪) كسوف المجهر المقلوب نيكون ، JPN الموديل: TE2000-S - إيزوبوبانول سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة I9030-4L - طقم الزيت الأحمر O أبكام ، الولايات المتحدة أب150678 مجموعة للتصور النسيجي للدهون المحايدة. بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة P6148-500G - البنسلين / الستربتومايسين ThermoFisher-Gibco ، الولايات المتحدة 15140-122 المضادات الحيوية 10,000 وحدة / مل البنسلين ، 10,000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين محلول ملحي مخزن بالفوسفات ThermoFisher-Gibco ، الولايات المتحدة 10010-023 - الماصات المصلية سارستيدت، أستراليا 86.1253.001 غير بيروجيني ، معقم ، 5 مل الماصات المصلية سارستيدت، أستراليا 86.1254.001 غير بيروجيني ، معقم ، 10 مل بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة S5761-1 كجم إعداد الإعلام الثقافي أوليات الصوديوم سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة SC-215879A - بالميتات الصوديوم سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة SC-215881 - تريبسين 0.05٪ / EDTA 0.53 ملي كورنينج ، الولايات المتحدة 25-052-كلتر - 24 مجموعة ثقافة خلايا البئر كورنينج ، الولايات المتحدة 3524 قاع مسطح مع غطاء. معالجة زراعة الأنسجة. غير بيروجينيك ، بوليسترين ، معقم. 1 / حزمة.