تلطيخ فون كوسا لخلايا العضلات الملساء الوعائية الأبهري: تقنية في المختبر لتقييم تكلس الطبقة الإنسية الشريانية

الملخص

المصدر: O'Rourke, C., et al. تكلس خلايا العضلات الملساء الوعائية وتصوير تكلس الأبهر والالتهابات. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تقنية تلطيخ لتقييم التكلس الإنسي الشرياني لخلايا العضلات الملساء الوعائية في المختبر. تستخدم طريقة فون كوسا تفاعلا كيميائيا ضوئيا لترسيب الفضة المعدنية في مواقع التكلس وإضفاء اللون الأسود.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف

1. عزل وتكلس VSMCs الأبهري الفئراني
   1. محلول هضم الأبهر:
      1. قم بإعداد محلول طازج (~ 3-5 مل لكل شريان أورطي محصود) بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) الذي يحتوي على 175 وحدة / مل من الكولاجيناز من النوع 2 و 1.25 وحدة / مل من الإيلاستاز. عقم المحلول بنظام ترشيح يعمل بالفراغ 0.22 ميكرومتر واحتفظ بالمحلول على الثلج حتى الاستخدام.
   2. وسائط الخلية:
      1. مكمل 500 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ مصل بقري للجنين ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
   3. وسائط التكلس:
      1. وسائط التكلس أ (NaPhos ؛ تستخدم في خطوط خلايا الفئران):
         1. مكمل 100-500 مل من DMEM (الحجم حسب الحاجة) مع مصل بقري للجنين بنسبة 10٪ ، و 2 ملي فوسفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
            أو
      2. وسائط التكلس B (βGP / Asc / DEX ؛ تستخدم في خطوط الخلايا الفأرية أو البشرية):
         1. مكمل 100-500 مل من DMEM (الحجم حسب الحاجة) مع مصل الأبقار الجنيني 10٪ ، 10 ملي مولار β-جليسروفوسفات ثنائي الصوديوم ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 10 نانومتر ديكساميثازون ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.

2. تشريح الماوس

1. القتل الرحيم للفأر بحقن البنتوباربيتال داخل الصفاق 200 ملغ/كغ.
2. ضع على لوح التشريح واستقر عن طريق لصق كل مخلب على اللوحة. باستخدام مجهر تشريح ومقص صغير ، قم بعمل شق خط الوسط يمتد من أسفل البطن إلى الجزء العلوي من الصدر.
3. قشر الجلد بالملقط وإزالة الصفاق ، وكشف عن أعضاء البطن. قم بإزالة أعضاء الجهاز الهضمي ، مع الحرص على عدم عبور الشريان الأورطي.
4. قم بعمل شق جانبي في الحجاب الحاجز الأمامي واستمر في الشق عبر البطن. باستخدام مقص التشريح ، حرر القفص الصدري عن طريق قطع جوانب الأضلاع وإزالة الأنسجة الرخوة الملتصقة بالجزء العلوي من القص. قم بإزالة القفص الصدري ، وكشف الرئتين.
5. اترك القلب في مكانه في البداية (للمساعدة في تحديد وتشريح الشريان الأورطي القريب) وقم بإزالة الرئتين بعناية. قم بإزالة الغدة الصعترية والقصبة الهوائية والمريء بعناية ، مع ضمان بقاء الشريان الأورطي سليما.
6. باستخدام ملقط دقيق مستقيم ومقص تشريح دقيق ، قم بإزالة الأنسجة الرخوة المحيطة بالشريان الأورطي من التشعب الحرقفي إلى قوس الأبهر ، مع الانتباه بعناية عند إزالة الدهون المحيطة بالأبهر (الشكل 1 أ). قم بإزالة الدهون المتبقية والأنسجة الرخوة المحيطة بالفروع الكبيرة للقوس الأبهري (أي الشرايين العضدية والسباتية الشائعة وتحت الترقوة ، الشكل 1 ب).
   ملاحظه: من المهم إزالة الدهون من الشريان الأورطي لأن الدهون يمكن أن تزيد من إشارة الخلفية عند إجراء التصوير الفلوري.
7. قم بإزالة القلب من التجويف الصدري ، وافصله بعناية عن الشريان الأورطي القريب ، وتخلص منه. قم بعبور الشريان الأورطي البعيد عند التشعب الحرقفي. باستخدام إبرة الأنسولين، قم بحقن محلول ملحي طبيعي في الشريان الأورطي من قوس الأبهر لغسل خلايا الدم المتبقية. افصل الشريان الأورطي مع أوعية قوس الأبهر ، وقم بإزالته تماما من الجسم.
8. ضع الشريان الأورطي في محلول ملحي عادي على الثلج حتى يصبح جاهزا للتصوير.

فئة

3. عزل خلايا العضلات الملساء الوعائية الأبهري الأولي للفئران

1. ضع الشريان الأورطي في HBSS بارد حتى تكتمل التشريح. قم بقطع أي دهون محيطة بالأبهر والأنسجة الرخوة المتبقية بعناية ، مع ترك الشريان الأورطي فقط.
2. تحت غطاء مزرعة الأنسجة المعقم ، انقل الشريان الأورطي إلى محلول هضم الأبهر في أطباق زراعة الأنسجة مقاس 35 مم × 10 مم. ضعها في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز متقطع لطيف. بعد الهضم ، تظهر الشريان الأورطي مظهرا ممدودا أو مهترئا.
3. باستخدام مجهر التسليح والملقط المعقم ، قم بإزالة الطبقة العرضية الخارجية للشريان الأورطي مع الحفاظ على الطبقة الإنسية سليمة. تتمثل إحدى تقنيات إزالة adventitia في تقشير الطبقة الخارجية من الشريان الأورطي في أحد طرفيه وإزالتها من الطبقة الإنسية الأساسية مثل الجورب الذي يمكن تقشيره وإزالته.
4. بمجرد إزالة الطبقة العرضية ، ضع الشريان الأورطي المتبقي في طبق جديد لزراعة الأنسجة مع وسائط زراعة الخلايا وقم بتخزينه في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 2-4 ساعات.
5. تحت غطاء معقم وباستخدام مقص تشريح دقيق معقم 3 مم ، قم بتقطيع الشريان الأورطي إلى حلقات بعرض 1-2 مم.
6. ضع هذه الحلقات في طبق جديد لزراعة الأنسجة باستخدام محلول هضم الأبهر واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع هزاز متقطع لطيف لمدة 120 دقيقة.
7. أضف 5 مل من وسائط زراعة الخلايا الدافئة إلى محلول الهضم وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
8. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
9. استنشق الوسائط وأعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب من وسائط زراعة الخلايا (على سبيل المثال ، 5 مل).
10. قم بوضع الكمية الكاملة من الخلايا المعزولة من كل شريان أورطي في قارورة ثقافة خلية مقاس 25 سم² وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. نشر الخلايا باستخدام التقنيات القياسية ، كما هو موضح سابقا. خلال الأيام الأولى من 7-10 أيام من الحضانة ، قم بتغيير الوسائط كل 72-96 ساعة. عندما تقترب الخلايا من التقاء ، قم بتجديد الوسائط بشكل متكرر (كل 48 ساعة).
    ملاحظه: قد يستغرق الأمر عدة أسابيع لنمو كمية كافية من الخلايا.
11. بمجرد التقاء ، تمر الخلايا التي تحتوي على التربسين الذي يتم تسخينه إلى 37 ^{درجة مئوية.}
    1. أضف 0.5-1.0 مل من التربسين إلى كل قارورة مزرعة واحتضانها لمدة 3-5 دقائق ؛ اضغط برفق على جانب القارورة كل 30-60 ثانية حسب الحاجة لفصل الخلايا عن السطح.
    2. بمجرد انفصال الخلايا عن قاع القارورة ، أضف 10 مل من وسائط الخلية إلى الخلايا الموجودة في التربسين. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق الوسائط والتربسين من حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في الكمية المطلوبة من وسائط الخلية الطازجة (على سبيل المثال ، 5-10 مل) ونقلها إلى قارورة جديدة (مع نقل بعض الخلايا إلى شريحة الغرفة).
12. في الممر الأول للخلايا ، قم بتأكيد سلالة خلايا العضلات الملساء باستخدام تقنيات الكيمياء المناعية القياسية ، كما هو موضح سابقا ، باستخدام جسم مضاد موجه ضد أكتين العضلات الملساء α.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تحفيز تكلس خلايا العضلات الملساء المستنبتة

1. تم الحصول على خلايا الألواح من 3.12 بتنسيق 6 آبار.
   ملاحظه: يوصى بالبدء ب 1 × 10⁵ خلايا / بئر بحجم إجمالي قدره 2.0 مل من الوسائط الخلوية لكل بئر.
2. السماح للخلايا بالنمو في وسائط التكلس A أو B لمدة 7 أيام على الأقل في شكل لوحة 6 آبار. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
3. قم بتغيير الوسائط الخلوية كل 48 ساعة.

< p class = "jove_title" >5. تقييم تكلس VSMC باستخدام طريقة تلطيخ فون كوسا

ملاحظة: تعتمد طريقة von Kossa لقياس تكلس المصفوفة خارج الخلية للأنسجة أو الخلايا المستنبتة على استبدال أيونات الكالسيوم المرتبطة بالفوسفات بأيونات الفضة. في وجود المركبات الخفيفة والعضوية ، يتم تقليل أيونات الفضة وتصورها على أنها فضة معدنية. تتم إزالة أي فضة غير متفاعلة عن طريق المعالجة بثيوسلفات الصوديوم. بروتوكول تلطيخ فون كوسا هو كما يلي:

1. استنشاق الوسائط من ألواح زراعة الخلايا.
2. قم بإصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من الفورمالين بنسبة 10٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
3. قم بإزالة الفورمالين واغسل الخلايا الثابتة بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
4. احتضان الخلايا في 1 مل من محلول نترات الفضة بنسبة 5٪ تحت لمبة 60-100 واط لمدة 1-2 ساعة.
5. استنشق محلول نترات الفضة واغسله بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة الفضة غير المتفاعلة عن طريق وضع الخلايا في 1 مل من محلول ثيوسلفات الصوديوم 5٪ (وزن / حجم) في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
7. اشطف الخلايا بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. صبغة فون كوسا جاهزة للتصوير باستخدام الفحص المجهري الضوئي المقلوب القياسي.
8. الخطوة الاختيارية: قم بتغطية البقع ب 1 مل من اللون الأحمر السريع لمدة 5 دقائق.

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: التشريح التمثيلي للشريان الأورطي من فأر من النوع البري. (أ) تم تصوير صورة للشريان الأورطي الصدري والبطني الممتد إلى تشعب الشريان الحرقفي المشترك بعد إزالة الأعضاء المغطى والدهون المحيطة بالأبهر. (ب) عرض مركز للقوس الأبهري مع الشرايين العضدية والسباتية المشتركة اليسرى والشرايين تحت الترقوة اليسرى. أشرطة المقياس = 1 مم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب مخروطي 15 مل صقر 352096 الجسم المضاد للأكتين في العضلات الملساء ألفا سيغما SAB2500963 شريحة الغرفة نونك لاب تيك 154461 كولاجيناز ، النوع 2 ورثينجتون LS004176 ديكساميثازون سيغما د4902 وسط النسر المعدل من Dulbecco تقنيات الحياة 11965-084 الإيلاستاز سيغما E1250 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 16000-044 ملقط ، نقطة دقيقة روبوز RS-4972 ملقط ، منحنى كامل مسننة روبوز RS-5138 الفورمالين (10٪) علوم المجهر الإلكتروني 15740 [م] محلول الملح المتوازن من هانك جيبكو 14025-092 حقنة الأنسولين مع إبرة تيرومو SS30M2913 حمض الأسكوربيك سيغما أ -7506 مقص زنبركي تشريح دقيق (13 مم) روبوز RS-5676 مقص زنبركي تشريح دقيق (3 مم) روبوز RS-5610 محلول ملحي عادي هوسبيرا 0409-4888-10 أحمر نووي سريع سيجما ألدريتش N3020 البنسلين / الستربتومايسين كورنينج 30-001-CI نترات الفضة (5٪) شركة ريكا للكيماويات 6828-16 فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي الهيدرات سيجما ألدريتش إس 9390 ثيوسلفات الصوديوم سيغما [س-1648] هيدرات ملح ثنائي الصوديوم ẞ-glycerophosphate سيغما جي 9422 قارورة زراعة الأنسجة، 25 سم 2 صقر 353108 لوحة زراعة الأنسجة (35 مم × 10 مم) صقر 353001 لوحة زراعة الأنسجة ، ستة آبار صقر 353046 التربسين كورنينج 25-053-CI نظام الترشيح المدفوع بالفراغ ميليبور SCGP00525