تلطيخ سلبي قائم على الكبسولة لعينات الفيروسات على شبكات TEM: تقنية تلطيخ المعادن الثقيلة لتصور البنية التحتية للفيروسات المغلفة

الملخص

المصدر: Blancett, C.D., et al. استخدام الكبسولات للتلوين السلبي للعينات الفيروسية داخل الاحتواء الحيوي. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نوضح التلوين السلبي لعينات الفيروس المغلفة باستخدام كبسولة معالجة داخل بيئة الاحتواء الحيوي. يمكن تصور الفيروسات الملطخة سالبا باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال للتحقيق في التركيب الفيروسي والتشكل بدقة نانومتر.

البروتوكول

1. طريقة الكبسولة للتعطيل في الاحتواء الحيوي مع 2٪ جلوتارالديهايد ، متبوعا بالتلوين السلبي في مختبر BSL-2

1. إجراء تعطيل الفيروسات.
   1. داخل BSC للاحتواء الحيوي ، امزج معلق الفيروس جيدا بنفس الحجم البالغ 4٪ جلوتارالديهايد لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 2٪ جلوتارالديهايد.
      أنذر: الجلوتارالديهايد مادة كيميائية خطرة وتتطلب حماية مناسبة. يمكن استخدام الجلوتارالديهايد لفترات وجيزة في BSC العادي ، لكن الكاشف المفتوح الممتد يتطلب العمل في BSC مجرى أو غطاء دخان كيميائي.
   2. قم بتعطيل الفيروسات باستخدام المثبت لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل التعبئة وإزالة التلوث ونقلها إلى منشأة BSL-2 EM.
2. في منشأة BSL-2 EM، استنشق الفيروس والخليط المثبت في الكبسولة، التي تحتوي على شبكتين من TEM، متصلة بماصة.
3. ضع الماصة أفقيا لمدة 10 دقائق مع توجيه الشبكات أفقيا.
   ملاحظه: هذا لتعزيز التوزيع المتساوي لجزيئات الفيروس على شبكات TEM.
4. التقط الماصة واضغط على المكبس لطرد الفيروس إلى حاوية النفايات. استنشق 40 ميكرولتر من الماء في الكبسولات وطردها في حاوية النفايات لمدة 3 دورات شطف.
5. استنشق 40 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل 1٪ (UA) أو 1٪ حمض فوسفوتنجستيك البوتاسيوم (PTA) في الكبسولات لمدة 30 ثانية
   ملاحظه: تراوح وقت التلوين من 10 ثوان إلى 1 دقيقة بناء على عينة الفيروس.
   أنذر: UA هو باعث ألفا ، وسم تراكمي. تعامل معها بحماية مناسبة.
6. قم بإزالة الكبسولة من الماصة وجفف الشبكات عن طريق لمس حافة الشبكات بقطعة من ورق الترشيح. جفف الشبكات بالهواء وقم بتخزينها لتصوير TEM اللاحق.

المواد