$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. بروتوكول تلطيخ الإيوسين
- لتثبيت عينات الأنسجة الرخوة ، املأ أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل بمحلول مثبت يحتوي على 9.5 مل من محلول الفورمالديهايد (FA) بنسبة 4٪ (حجم / حجم) و 0.5 مل من حمض الخليك الجليدي (AA).
ملاحظه: قم بإعداد محلول FA طازجا من محلول FA خال من الأحماض بنسبة 37٪ مثبت بحوالي 10٪ من الميثانول. قم بتخفيف محلول FA بشكل أكبر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco. اختر DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. احتفظ بمحلول FA المخفف لمدة لا تزيد عن شهر واحد. أثناء التحمض ، يتغير الرقم الهيدروجيني للمحلول المثبت من محايد إلى حوالي 3.
أنذر: نظرا لأن FA سام حاد للأعضاء ومسببا للتآكل ومسرطن ، فإن استخدام غطاء الدخان إلزامي ويجب استخدام المعدات الشخصية الواقية المناسبة.
- أضف عينة الأنسجة الرخوة التي تمت إزالتها حديثا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتبريد أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل لمدة 24-72 ساعة < ب / >
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
- اغسل عينة الأنسجة الرخوة بمحلول DPBS لمدة 1 ساعة.
- لتلطيخ عينة الأنسجة الرخوة المثبتة (على سبيل المثال ، كلية فأر كاملة) ، ضع الأنسجة الرخوة في 2 مل من محلول تلطيخ اليوزين Y واحتضن العينة لمدة 24 ساعة. احتفظ بالعينة على لوحة اهتزاز أفقية للحصول على هزاز سلس (حوالي 60 دورة في الدقيقة) أثناء عملية الحضانة><.
ملاحظه: يحتوي محلول تلطيخ اليوزين Y على تركيز 30٪ (وزن / حجم) في الماء المقطر. اختر حجم محلول التلوين بحيث يتم تغطية العينة بالكامل بمحلول التلوين والسماح للعينة بالتحرك بحرية داخل حاوية العينة. قد يختلف وقت الحضانة باختلاف العينات الأخرى ويجب تعديله وفقا لذلك.
- بعد التلوين ، قم بإزالة عينة الأنسجة الرخوة بعناية من حاوية العينة.
- قم بإزالة فائض عامل التلوين بعناية باستخدام مناديل السليلوز.
- ضع عينة الأنسجة الرخوة في حاوية عينة مخروطية فوق مرحلة بخار الإيثانول للتخزين والاستخدام الإضافي.
ملاحظه: يجب أن تحتوي حاوية العينة المخروطية دائما على بضع قطرات من 70٪ من الإيثانول (حجم / حجم) في قاع الأنبوب للحفاظ على رطوبة عينة الأنسجة الرخوة ومنع القطع الأثرية.